徐愛(ài)萍，林 華，高麗輝，李 玲，陳夢(mèng)威，王 歌，楊 娟，牛艷芬

（昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究中心，云南 昆明 650500）

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎病的必經(jīng)過(guò)程[1]，RIF的主要病理特征為大量細(xì)胞外基質(zhì)成分（extracellular matrix，ECM）如纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、Ⅰ型膠原（collagen type Ⅰ，Col Ⅰ）等在腎間質(zhì)沉積并形成瘢痕，從而破壞腎臟結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腎功能受損[2-3]。

在腎臟損傷過(guò)程中，多種因子（如TGF-β1）可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞，并導(dǎo)致ECM蛋白沉積的過(guò)程被稱為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。大量研究表明，EMT是RIF的發(fā)生和發(fā)展中重要的病理生理過(guò)程，是啟動(dòng)和維持RIF的關(guān)鍵機(jī)制[4-5]。芒果苷元（norathyriol，NL）屬于雙苯并吡喃酮類黃酮化合物，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)芒果苷元能降低血尿酸水平且改善動(dòng)物腎功能，已經(jīng)申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利（申請(qǐng)?zhí)枺?01610181082.3），尤其是對(duì)腎小管具有很好的保護(hù)作用。本研究擬采用TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）成EMT模型，以苯溴馬隆作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察芒果苷元對(duì)HK-2細(xì)胞EMT的影響，為芒果苷元腎保護(hù)作用的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2），購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；芒果苷元，昆明制藥集團(tuán)股份有限公司；苯溴馬隆，阿拉丁；人重組TGF-β1，Peprotech；MTT，Amresco公司；DMEM干粉培養(yǎng)基，Gibico；DMSO，Biofroxx；胎牛血清，Gibico；胰蛋白酶干粉，Amresco公司；Transwell小室，Corning；結(jié)晶紫，Meilunbio；兔抗Fibronectin抗體，萬(wàn)類生物；兔抗ColⅠ抗體，萬(wàn)類生物；山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記，中山金橋。

1.2 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱為Thermo產(chǎn)品，型號(hào)heracell 150i；倒置顯微鏡為Olympus產(chǎn)品，型號(hào)CKX41；全波長(zhǎng)紫外-可見(jiàn)光酶標(biāo)儀為美國(guó)Biotek產(chǎn)品，型號(hào)Synergy2；高壓鍋為上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品，型號(hào)LDZX-50KBS；恒溫?fù)u床為博彩產(chǎn)品。型號(hào)THZ-032；超低溫冰箱為美國(guó)Thermo Electron公司產(chǎn)品，型號(hào)Forma-86 C991。

1.3 方法

細(xì)胞培養(yǎng)：人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)，隔2 d換液。

MTT法檢測(cè)芒果苷元對(duì)HK-2細(xì)胞活力的影響：選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HK-2細(xì)胞，待其生長(zhǎng)達(dá)70%～80%融合時(shí)，按5×103個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，加入無(wú)FBS的DMEM培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞過(guò)夜，使細(xì)胞同步化于G0期。給以芒果苷元（10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L）和苯溴馬?。?0-7mol/L）干預(yù)48 h，48 h后，每孔加20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，震蕩混勻10 min，492 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞相對(duì)活力（%）=（處理孔OD492/正常對(duì)照孔OD492）×100[6]。

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HK-2細(xì)胞，待其生長(zhǎng)達(dá)70%～80%融合時(shí)，接種至六孔板（種板前用marker筆在六孔板背后均勻的劃?rùn)M線，大約每隔0.5 cm一道，使每孔至少有五條線穿過(guò)，便于后續(xù)拍照時(shí)定位），將細(xì)胞分為正常組、模型組（TGF-β1誘導(dǎo)組）、芒果苷元10-8、10-7、10-6mol/L組和苯溴馬隆10-7mol/L組。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)細(xì)胞，待其貼壁后，將含10% FBS的培養(yǎng)基換成無(wú)FBS培養(yǎng)基，使細(xì)胞同步化于G0期。加入各濃度芒果苷元（10-8、10-7、10-6mol/L）和苯溴馬?。?0-7mol/L），培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)4 h，4 h后用200 μL槍頭垂直于marker筆所劃?rùn)M線劃痕，每孔劃5條，PBS洗滌3次，重新加入系列濃度芒果苷元和苯溴馬隆，同時(shí)給以10 ng/mL的TGF-β1誘導(dǎo)，在TGFβ1誘導(dǎo)后第0 h和24 h時(shí)，每孔選取六個(gè)點(diǎn)拍照，計(jì)算24 h遷移率。遷移率（%）=（0 h劃痕寬度-測(cè)定時(shí)劃痕寬度）/ 0 h劃痕寬度× 100%[6]。

Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力：用無(wú)FBS培養(yǎng)基稀釋Matrige，鋪于24孔Transwell小室的上室，放入37 ℃培養(yǎng)箱，待Matrigel凝固后，小心吸走上室液體，細(xì)胞消化后用無(wú)FBS培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，接種于上室，下室加入含10% FBS的培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h，吸棄上室培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦去上室細(xì)胞，并用PBS洗滌2次，甲醇在室溫固定20 min，再用PBS洗2次，結(jié)晶紫室溫染色20 min，PBS洗3次，100×倒置顯微鏡下選4個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)穿過(guò)上室的細(xì)胞數(shù)。

Western bolt免疫印跡實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入含有蛋白酶抑制劑、PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解細(xì)胞，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下并收集至EP管，離心后取上清，將收集好的蛋白樣品定量，加5×loading buffer，100 ℃變性，在壓縮膠（60 V，30 min），分離膠（110 V，80 min）條件下，進(jìn)行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳，260 mA，90 min，冰水浴條件下轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，用5%脫脂牛奶稀釋一抗至適當(dāng)濃度，4 ℃ 封閉過(guò)夜，次日洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵2 h，洗膜，BIO-RAD化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行成像，采用Image j分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，求出各條帶的光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用Graphpad prsim5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用Dunnett法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芒果苷元對(duì)HK-2細(xì)胞活力的影響

圖1所示，與正常組相比，芒果苷元各濃度組及苯溴馬隆組對(duì)HK-2細(xì)胞活力無(wú)明顯影響（P＞0.05）。

圖1 芒果苷元對(duì)HK-2細(xì)胞活力的影響（，n=3）Fig.1 Effect of norathyriol on HK-2 cell viability

2.2 芒果苷元對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響

如圖2所示，在倒置顯微鏡下（40×），正常的HK-2細(xì)胞為鵝卵石狀、鋪路石狀、圓形或者橢圓形，細(xì)胞與細(xì)胞之間連接緊密，TGF-β1作用24 h后，模型組細(xì)胞變長(zhǎng)，細(xì)胞之間連接松散，變?yōu)殚L(zhǎng)梭形；在給以芒果苷元10-8、10-7、10-6mol/L和苯溴馬?。?0-7mol/L）干預(yù)之后，與模型組相比，橢圓形細(xì)胞增多。

圖2 芒果苷元對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)24 h后的HK-2細(xì)胞形態(tài)變化的影響（40×）Fig.2 Effect of norathyriol on the morphological changes of HK-2 cells induced by TGF-β 1 for 24 h（40×）

2.3 芒果苷元對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞遷移能力的影響

與正常組比，TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞24 h后，模型組遷移率顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，0.01）；與模型組相比，芒果苷元10-8，10-7，10-6mol/L組及苯溴馬隆組遷移率顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，0.01），見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 芒果苷元對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)后HK-2細(xì)胞遷移率的影響（40×）Fig.3 Effect of norathyriol on the migration of HK-2 cells induced by TGF-β 1（40×）

圖4 芒果苷元對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)后的HK-2細(xì)胞的遷移率的影響（，n=3）Fig.4 Effect of norathyriol on the migration of HK-2 cells induced by TGF-β1（，n=3）

2.4 芒果苷元對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞侵襲能力的影響

TGF-β1（10 ng/mL）誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞后，與正常組比，模型組侵襲能力顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，芒果苷元10-6mol/L組細(xì)胞侵襲能力顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與苯溴馬隆組相比，等濃度芒果苷元（10-7mol/L）組侵襲率無(wú)明顯變化（P＞0.05），如圖5，圖6。

圖5 芒果苷元對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞侵襲能力的影響（100×）Fig.5 Effect of norathyriol on invasion of HK-2 cells induced by TGF-β 1（100 ×）

圖6 芒果苷元對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞侵襲能力的影響（，n=3）Fig.6 Effect of norathyriol on invasion of HK-2 cells induced by TGF-β 1（，n=3）

2.5 芒果苷元對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ColⅠ和FN蛋白表達(dá)水平的影響

2.5.1 芒果苷元對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ColⅠ蛋白表達(dá)水平的影響與正常組相比，模型組細(xì)胞ColⅠ表達(dá)顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，芒果苷元10-6mol/L組和苯溴馬隆組細(xì)胞ColⅠ表達(dá)顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，0.01），見(jiàn)圖7。

圖7 芒果苷元對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ColⅠ蛋白表達(dá)水平的影響（，n=3）Fig.7 Effect of norathyriol on expression of colIprotein in HK-2 cells induced by TGF-β1（，n=3）

2.5.2 芒果苷元對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞FN蛋白表達(dá)水平的影響與正常組相比，模型組細(xì)胞FN蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，芒果苷元10-6mol/L組細(xì)胞FN蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖8。

圖8 芒果苷元對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞FN表達(dá)水平的影響（，n=3）Fig.8 Effect of norathyriol on expression of FN protein in HK-2 cells induced by TGF-β1（，n=3）

3 討論

TGF-β1是公認(rèn)的最強(qiáng)的纖維化誘導(dǎo)因子，在體外可誘導(dǎo)多種上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。在RIF過(guò)程中，TGF-β1可刺激腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)RIF的發(fā)生發(fā)展[7-8]。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[9-11]，給以10 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞，復(fù)制腎小管上皮細(xì)胞EMT模型，在此模型上研究芒果苷元對(duì)EMT的作用及其機(jī)制。

正常HK-2細(xì)胞呈鋪路石形，細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密連接，在發(fā)生EMT時(shí)細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生改變，可由原來(lái)的圓形或橢圓形變成長(zhǎng)梭形，且細(xì)胞與細(xì)胞間的間距變大，細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞間間距的改變可反映腎小管上皮細(xì)胞EMT的程度[12]，本實(shí)驗(yàn)給以TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞24 h時(shí)后拍照，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)在TGF-β1誘導(dǎo)后24 h時(shí)，模型組細(xì)胞發(fā)生明顯的表型轉(zhuǎn)化，細(xì)胞由鵝卵石形態(tài)轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)梭形，提示HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT；在給以芒果苷元干預(yù)后，部分HK-2細(xì)胞能維持鋪路石形態(tài)，提示芒果苷元能抑制TGFβ1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞形態(tài)的變化。

正常腎小管上皮細(xì)胞最顯著的特征是具有端-基極性且細(xì)胞與細(xì)胞間保持緊密的連接，他們緊密的排列并粘附于腎小管基底膜上形成單層結(jié)構(gòu)，因此幾乎沒(méi)有運(yùn)動(dòng)能力，而成纖維細(xì)胞沒(méi)有粘附到任何膜上，沒(méi)有細(xì)胞極性，也不會(huì)形成單層結(jié)構(gòu)，能夠自由的移動(dòng)。在外界誘導(dǎo)因素刺激下，發(fā)生EMT的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)成纖維細(xì)胞，獲得遷移和侵襲能力，穿過(guò)腎小管基底膜，轉(zhuǎn)化為能分泌大量ECM的肌成纖維細(xì)胞，參與RIF進(jìn)程[12]，因此遷移和侵襲能力可間接反映細(xì)胞EMT的程度。本實(shí)驗(yàn)用劃痕實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)TGFβ1誘導(dǎo)24 h后HK-2細(xì)胞的遷移能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在TGF-β1誘導(dǎo)24 h后，模型組HK-2細(xì)胞遷移率顯著升高，說(shuō)明腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，符合EMT模型特征。給以芒果苷元后，HK-2細(xì)胞遷移率有不同程度的下降，提示芒果苷元能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的遷移，抑制EMT的進(jìn)程。Transwell法可用于檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，將細(xì)胞接種于預(yù)先鋪好Matrigel的上室，培養(yǎng)24 h，再將穿膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力，本實(shí)驗(yàn)中，模型組HK-2細(xì)胞穿膜數(shù)顯著增多，提示TGF-β1誘導(dǎo)后細(xì)胞獲得侵襲能力，能夠穿過(guò)Matrigel，給以芒果苷元后，HK-2細(xì)胞侵襲能力顯著下降，提示芒果苷元能降低由TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲，抑制EMT的發(fā)展。

RIF的主要特征即為ECM在腎間質(zhì)的積聚，腎臟ECM成分主要來(lái)源于活化的間質(zhì)成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞可由多種細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)，其中腎小管上皮細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞的重要來(lái)源之一，有研究表明肌成纖維細(xì)胞分泌ECM的能力是成纖維細(xì)胞的4～5倍，表明腎小管上皮細(xì)胞EMT在RIF發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。腎臟ECM成分主要包括膠原，糖蛋白以及蛋白聚糖三類物質(zhì)，在正常生理?xiàng)l件下，腎小管上皮細(xì)胞即可產(chǎn)生少量ECM成分，用于形成腎小管基底膜以及維持腎臟生理結(jié)構(gòu)，F(xiàn)N屬于糖蛋白類ECM，F(xiàn)N在生理狀態(tài)下少量表達(dá)參與腎小管基底膜的形成，而在外界刺激發(fā)生EMT時(shí)，F(xiàn)N的沉積最早出現(xiàn)并持續(xù)增加，F(xiàn)N的表達(dá)水平可用來(lái)評(píng)判纖維化程度，而膠原成分中的ColⅠ常常被認(rèn)為可以引發(fā)腎臟纖維化，ColⅠ的高表達(dá)與腎臟纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[12-14]。本實(shí)驗(yàn)中，TGFβ1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞48 h后，模型組HK-2細(xì)胞中FN和ColⅠ蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，給以芒果苷元后，蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，提示芒果苷元可降低FN、ColⅠ等ECM成分延緩EMT。