王瑞靜，錢長敏，田介峰，李瑞明，靳元鵬，羅學(xué)軍*

（1.天士力控股集團(tuán)有限公司天士力研究院，天津 300410；2.天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300410）

復(fù)方丹參滴丸具有活血化瘀、理氣止痛的功效，是臨床治療氣滯血瘀所致的心絞痛、冠心病的常用藥，廣泛用于各類心腦血管疾?。?-2］。其活性成分主要來自于原藥材丹參、三七中的酚酸類及皂苷類成分，三七皂苷R1是復(fù)方丹參滴丸的主要活性成分之一，為滿足復(fù)方丹參滴丸國際化申報(bào)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、臨床樣品的檢測放行、藥效學(xué)、藥代學(xué)等各項(xiàng)研究需求，為此研究三七皂苷R1對照品制備過程，并對其進(jìn)行賦值及質(zhì)量研究。

1 儀器和試藥

1.1 儀器KDM型電熱套；低速大容量多管離心機(jī)；R220SE BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；玻璃色譜柱；LC80-600動(dòng)態(tài)軸向加壓色譜儀；VT6130真空干燥箱；Agilent 1260高 效 液 相 色 譜 儀；Advance DRX 500 Bruker型核磁共振儀；METTLER XP205電子天平。

1.2 試藥 三七飲片（批號201505006，云南天士力三七種植有限公司）；天津海光D101型大孔吸附樹脂；D941型大孔吸附樹脂；青島海洋化工柱層析硅膠（100～200目，200～300目）；Dikma色譜純乙腈；Sigma色譜純甲醇；水為自制超純水；其余試劑均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品候選物的制備 取三七藥材，粉碎成粗顆粒，取3 kg，分別加入3個(gè)熱回流提取器、分別加入6 L 70%乙醇提取兩次（2.5 h、2 h），合并提取液，減壓濃縮至藥材量的1.5倍體積，靜置至室溫，用低速大容量多管離心機(jī)（4 200 r/min，20 min）離心得上清液A。將上清液A加入填裝好的D101型大孔樹脂色譜柱中（3 kg樹脂），依次用水除雜，水洗液棄去，再用30%乙醇洗脫，收集洗脫液，TLC色譜監(jiān)測流出液，將洗脫液移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，濃縮至無醇味，得濃縮液B。將濃縮液B加入填裝好的D941型大孔吸附樹脂色譜柱中。用水沖洗D941大孔樹脂色譜柱，收集上樣流出液C及水洗脫液，上樣流出液C和水洗脫液減壓濃縮至干得三醇組總皂苷D 180 g。用硅膠（200～300目）柱層析色譜法分離，用乙酸乙酯-乙醇1∶4為流動(dòng)相洗脫分離得兩部分，一部分是含有人參皂苷Rg1的粗品E，另一部分是含有三七皂苷R1和人參皂苷Re的混合物F，F(xiàn)經(jīng)動(dòng)態(tài)軸向加壓色譜進(jìn)行精制純化，制備得高純度三七皂苷R12.3 g，色譜純度為100%。

2.2 表征-化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 質(zhì)譜分析 使用ESI源，負(fù)離子模式按《中國藥典》2015版＜0431＞所規(guī)定的方法對經(jīng)均一化處理試樣進(jìn)行分析，結(jié)果顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z:931.526 8[M-H]-（calc.for C47H79O18，931.527 2），以及相關(guān)離子峰m/z:977.531 9[M＋HCOO]-，提示該化合物的分子式為C47H80O18。化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2.2核磁共振分析 將經(jīng)均一化處理試樣溶于DMSO-d6中，按《中國藥典》2015版＜0441＞所規(guī)定的方法進(jìn)行核磁共振分析。通過對三七皂苷R1的核磁數(shù)據(jù)分析及相關(guān)文獻(xiàn)查閱［3］，將三七皂苷R1的13C核磁共振數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸屬。見表1。

2.2.3 紅外分析 采用KBr壓片法按USP 40＜197＞和＜851＞所規(guī)定的方法對經(jīng)均一化處理試樣進(jìn)行紅外分析。紅外圖譜顯示在3 300 cm-1附近出現(xiàn)羥基的特征吸收峰；在1 070 cm-1附近出現(xiàn)C-O伸縮振動(dòng)吸收峰，進(jìn)一步提示羥基結(jié)構(gòu)的存在；2 900 cm-1附近的吸收峰為C-H伸縮振動(dòng)吸收峰。支持三七皂苷R1的結(jié)構(gòu)。

2.2.4 紫外分析 將經(jīng)均一化處理試樣溶于甲醇配成稀溶液按USP 40＜197＞和＜851＞所規(guī)定的方法進(jìn)行紫外測試。紫外圖譜顯示試樣在205 nm附近有最大吸收，提示試樣結(jié)構(gòu)無發(fā)色團(tuán)。以上信息支持三七皂苷R1的結(jié)構(gòu)。綜上，鑒定為三七皂苷R1對照品候選物。

2.3 賦值-質(zhì)量守恒法計(jì)算相對純度

2.3.1 HPLC法測定色譜純度

2.3.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表2程序進(jìn)行梯度洗脫；流速：1 ml/min；檢測波長203 nm；柱溫：30℃。

表2 梯度洗脫程序

2.3.1.2 測定結(jié)果 取三七皂苷R1對照品候選物約4 mg，精密稱定，用甲醇溶解制成每1 ml含0.4 mg的溶液，精密量取對照品溶液10 μl進(jìn)樣分析。在203 nm下，除主峰外，無雜質(zhì)峰檢出，其歸一化法色譜純度100%，見圖2。

圖2 三七皂苷R1 HPLC色譜圖

2.3.2 水分 將三七皂苷R1對照品候選物按照USP37-NF29＜921＞Ⅰa所規(guī)定的Karl-Fischer方法進(jìn)行水分測定，結(jié)果為3.55%。

2.3.3 殘留溶劑 將三七皂苷R1對照品候選物按照USP37-NF32＜467＞所規(guī)定方法進(jìn)行溶劑殘留分析，結(jié)果含乙醇36.4 ppm。

2.3.4 灰分 將三七皂苷R1對照品候選物按照USP37-NF29＜281＞所規(guī)定方測定灰分，結(jié)果為0.45%。

2.3.5 質(zhì)量守衡法計(jì)算結(jié)果 相對純度=色譜純度×（1-水分含量-殘留溶劑含量-灰分含量）×100%=100%×（1-3.55%-0.003 64%-0.45%）×100%=96.00%。則得三七皂苷R1對照品，相對純度為96.00%。

3 討論

三七飲片經(jīng)提取、D101型大孔樹脂富集、D941大孔樹脂柱脫色，硅膠柱層析分離、ODS C18色譜精制純化、其色譜純度達(dá)到99.5%以上，滿足對照品候選物的要求［4］。該制備工藝經(jīng)過后期反復(fù)確認(rèn)，重現(xiàn)性良好。

中藥國際申報(bào)CMC研究中，缺少對照品成為其不可避免的瓶頸問題，如果對照品是從非監(jiān)管當(dāng)局認(rèn)可來源獲得，比如企業(yè)自制的對照品，則需要進(jìn)行充分的研究，包括制備、結(jié)構(gòu)鑒定、標(biāo)化賦值、包裝、穩(wěn)定性考查等［4-5］。自制對照品具有可溯源性是所有對照品的基本特征，直接與測量的可靠性相關(guān)，在對照品的制備過程中要時(shí)刻考慮其溯源性、同質(zhì)性、均勻性和穩(wěn)定性。