王洋洋，佟若菲，孫燕燕

（天津市兒童醫(yī)院，天津 300400）

清肺抑火片收載于《國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》WS3-B-0418-90-1中，由黃柏、大黃、黃芩等成分組成，具有清肺止嗽、降火生津功效，臨床主要用于咳嗽、發(fā)熱、便秘等癥狀。黃柏有效成分為鹽酸小檗堿，大黃有效成分為大黃素和大黃酚。本研究采用雙波長法同時(shí)測定該制劑中黃柏和大黃所含3個(gè)組分的含量，該方法專屬性強(qiáng)，操作簡單，可有效控制該制劑的質(zhì)量［1］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-2010AHT高效液相色譜儀，LC solution工作站。色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；梅特勒AB265-S電子天平；島津UV2600紫外-可見分光光度計(jì)。

1.2 試藥 乙腈（色譜純，霍尼韋爾有限公司）、甲醇（分析純，天津市鑫鉑特化工有限公司）、磷酸（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、水為純化水。鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110713-201814，含量86.7%），大黃素對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110756-201512，含量98.7%），大黃酚對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110796-201621，含量99.2%）。清肺抑火片（天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司隆順榕制藥廠，批號(hào)200024、200034、200044；規(guī)格：0.61 g/片）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.2%磷酸溶液，按表1的時(shí)間程序進(jìn)行洗脫；柱溫為35℃，進(jìn)樣量20 μl，體積流量為1.0 ml/min。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。設(shè)定345 nm為鹽酸小檗堿的檢測波長，254 nm為大黃素和大黃酚的檢測波長。

表1 梯度洗脫程序

2.2溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品15.34 mg加甲醇溶解至20 ml量瓶中，稱取大黃素對(duì)照品12.51 mg加甲醇溶解并定容至100 ml量瓶中，稱取大黃酚對(duì)照品12.55 mg加甲醇溶解并定容至50 ml量瓶中，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取上述儲(chǔ)備液用甲醇溶解并稀釋制成每1 ml含鹽酸小檗堿約13.3 μg、大黃素約2.5 μg、大黃酚約5.0 μg的溶液，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品細(xì)粉約0.3 g，精密稱定，置100 ml三角瓶中，精密加入甲醇50 ml并稱定重量，超聲處理（功率240 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻至室溫后用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 按處方分別稱取缺少黃柏、大黃的藥材適量，按供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以345 nm和254 nm為檢測波長，對(duì)上述溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1-2。供試品溶液主峰的保留時(shí)間與對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間一致，陰性樣品無干擾。

圖1 對(duì)照品（A）供試品（B）陰性樣品（C）HPLC色譜圖（345 nm）

圖2 對(duì)照品（A）供試品（B）陰性樣品（C）HPLC色譜圖（254 nm）

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別取對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇制成每1 ml中分別含鹽酸小檗堿3.32～33.25 μg、大黃素0.61～6.13 μg、大黃酚1.25～12.45 μg的混合對(duì)照溶液。分別進(jìn)樣測定峰面積，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，求得鹽酸小檗堿回歸方程：Y=87 665X＋9 778.9（r=0.999 9，n=5）；大黃素回歸方程Y=93 859X-2 602.3（r=0.999 9，n=5）；大黃酚回歸方程Y=101 091X-4 138.4（r=0.999 9，n=5）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿在3.32～33.25 μg/ml、大黃素在0.61～6.13 μg/ml、大黃酚在1.25～12.45 μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣6次。測得鹽酸小檗堿峰面積RSD為0.5%，大黃素RSD為0.4%，大黃酚RSD為0.4%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批清肺抑火片（批號(hào)200034）6份分別制備供試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果每片樣品中鹽酸小檗堿平均含量為0.920 mg，RSD為0.9%；大黃素平均含量為0.250 mg，RSD為0.8%；大黃酚平均含量為0.540 mg，RSD為0.8%。表明此方法重現(xiàn)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8和10 h進(jìn)樣測定。測得鹽酸小檗堿峰面積RSD為0.8%，大黃素RSD為0.7%，大黃酚RSD為0.7%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn) 分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液各適量，加甲醇制成濃度為含鹽酸小檗堿0.079 8 mg/ml、大黃素0.024 5 mg/ml、大黃酚0.049 8 mg/ml的混合對(duì)照品溶液；另取9份已知含量的樣品（批號(hào)200034），每份約0.15 g，精密稱定，分別精密加入上述混合對(duì)照品溶液2.4、3.0和3.6 ml各3份，再加甲醇分別稀釋至50 ml，進(jìn)樣分析。測得鹽酸小檗堿平均回收率為98.87%，RSD為1.46%；大黃酚平均回收率98.66%，RSD為1.33%；大黃素平均回收率100.53%，RSD為1.72%。說明此方法回收率符合要求。結(jié)果見表2-4。

表2 鹽酸小檗堿回收率試驗(yàn)測定結(jié)果（n＝9）

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2.9 樣品測定 取清肺抑火片3批，分別制備供試品溶液，并進(jìn)行測定，結(jié)果見表5。

表4 大黃素回收率試驗(yàn)測定結(jié)果（n＝9）

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3 討論

3.1 檢測波長的選擇參考《中國藥典》2015年版一部［2］黃柏及大黃含量測定項(xiàng)下檢測波長，經(jīng)紫外光譜掃描結(jié)果得知，大黃素和大黃酚最大吸收波長為254 nm，鹽酸小檗堿最大吸收波長為345 nm，為提高檢測靈敏度，故本試驗(yàn)選用雙波長法進(jìn)行測定。

3.2 流動(dòng)相的確定經(jīng)查閱文獻(xiàn)可知［3-6］，0.2%磷酸溶液-乙腈適用于鹽酸小檗堿、大黃素和大黃酚的檢測。本試驗(yàn)考查了不同比例的0.2%磷酸溶液-乙腈流動(dòng)相系統(tǒng)，梯度洗脫，結(jié)果顯示按照本試驗(yàn)中的梯度可將各目標(biāo)成分有效分離。

3.3 提取方法的確定本次試驗(yàn)分別采用加熱回流法和超聲法分別以50%、70%和純甲醇作為提取溶劑進(jìn)行提取。結(jié)果表明，以純甲醇為提取溶劑，采用超聲法提取30 min，可將主成分提取完全。