車 爽，周 軍，曲 佳

（天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300000）

婦康寶口服液由熟地黃、川芎、白芍、艾葉、當(dāng)歸、甘草、阿膠共七味藥組成，該藥出自《金匱要略》卷下的經(jīng)典名方“芎歸膠艾湯”。當(dāng)歸、艾葉、川芎提取揮發(fā)油，藥渣與白芍、熟地黃、甘草加水煎煮2次，第1次3 h，第2次2 h，合并煎液，靜置18～24 h，濾過，濾液濃縮至適量；另取紅糖404 g制成糖漿，阿膠加水加熱溶化，分別加入上述溶液中，加熱攪拌，放冷，加入上述揮發(fā)油及適量的水，混勻，制成1 000 ml，灌裝，即得。該品種具有補(bǔ)血調(diào)經(jīng)，止血安胎的功效。主要用于治療失血過多，面色萎黃，月經(jīng)不調(diào)，小腹冷痛，胎漏胎動，痔漏下血等癥［1］。婦康寶口服液方中重用川芎、當(dāng)歸，取其川芎活血行氣開郁，當(dāng)歸補(bǔ)血活血調(diào)經(jīng)之力［2-3］。川芎、當(dāng)歸中所含阿魏酸是用以衡量二者質(zhì)量的有效成分之一。雖然阿魏酸在中藥材中分布較為廣泛，但經(jīng)科學(xué)研究確實(shí)發(fā)現(xiàn)了許多阿魏酸及其衍生物的藥理作用和生物活性［4-5］。因此，測定處方中阿魏酸的含量，對該品種的質(zhì)量評價(jià)具有積極的意義。本試驗(yàn)在考量制法工藝及中醫(yī)理論的基礎(chǔ)上，建立了以高效液相色譜法測定方中具有活血化瘀，調(diào)經(jīng)止痛作用的當(dāng)歸、川芎兩味藥中阿魏酸含量的方法，并測定了來自4家企業(yè)的54批次樣品中阿魏酸的含量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器Shimadzu LC-20AD高效液相色譜儀；DAD檢測器。

1.2 試劑 阿魏酸（購自中國食品藥品檢定研究院，批號110773-201614，99.0 %，供含量測定用）；甲醇（色譜純，默克股份有限公司）；乙腈（色譜純，默克股份有限公司）；磷酸（分析純，天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠）；乙醇、乙醚（分析純，天津市康科德科技有限公司）；水為Milli-Q超純水。樣品為市售品，均來自于2019年國家藥品評價(jià)性抽驗(yàn)項(xiàng)目所抽驗(yàn)樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用phenomenex Luna C18（2）100?（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；以乙腈為流動相A，以0.1 %磷酸溶液為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為321 nm；柱溫35℃，流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量10 μl。理論板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取阿魏酸對照品適量，精密稱定，加70 %甲醇制成每1 ml含5 μg的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品10 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，加乙醇至刻度，振搖5 min，離心，精密量取上清液25 ml，蒸干，用水20 ml分次洗滌蒸發(fā)皿，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用乙醚振搖提取3次，每次20 ml，合并乙醚液，低溫蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方配比，取除當(dāng)歸、川芎外的各味藥材，按工藝制備成陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定。結(jié)果表明陰性樣品溶液對測定無干擾。見圖1。

圖1 對照品（A）供試品（B）陰性樣品（C）HPLC色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取阿魏酸對照品適量，精密稱定，加70%甲醇分別制成每1 ml各含1.589 0、2.648 2、5.296 5、7.944 8和10.593 0 μg的溶液，精密吸取上述溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，分別測定峰面積，以對照品濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：Y=49 341.66X＋1 211.02（r=1.000 0）。結(jié)果表明阿魏酸在1.589 0～10.593 0 μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度考查 取同一批號婦康寶口服液（批號180101）10 g，精密稱定，依“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析6次。阿魏酸峰面積的RSD為1.7%。

2.6 重復(fù)性考查 取同一批號婦康寶口服液（批號180101）10 g，精密稱定，共6份，依“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定每份樣品中阿魏酸的含量。結(jié)果阿魏酸平均含量為12.422 7 μg/g，RSD為1.1 %，重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性考查 取同一批號婦康寶口服液（批號180101）10 g，精密稱定，依“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別在0、4、12及24 h測定樣品中阿魏酸的峰面積，結(jié)果峰面積值的RSD為1.8 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取“2.6”項(xiàng)下已測知阿魏酸含量的婦康寶口服液（批號180101）5 g，精密稱定，共6份，分別精密加入濃度為0.844 47 μg/ml的對照品溶液50 ml。依“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為97.13 %，RSD為2.0 %。見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 樣品測定及結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析 依“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定54批次樣品中阿魏酸的含量，結(jié)果見表3和表4。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 提取方法的考查 本研究采用乙醇和1 %碳酸氫鈉為提取溶劑，結(jié)果表明使用乙醇能夠提取完全；采用振搖和超聲的方式提取，結(jié)果表明兩種方法提取效率相當(dāng)，但振搖提取時(shí)間短，最終選擇振搖方式提??；分別考查了用乙醚和乙酸乙酯萃取，結(jié)果兩者提取效率相當(dāng)，最終選擇用乙醚提??；進(jìn)一步考查了不同萃取次數(shù)（3、4、5次），結(jié)果萃取3次即可提取完全；最后考查了不同溶劑倍數(shù)的影響（10 g→50 ml、2 g→50 ml），結(jié)果取10 g樣品加入50 ml溶劑提取含量稍高。

3.2 色譜條件的考查 參考大量文獻(xiàn)［6-8］及《中國藥典》2015年版一部有關(guān)該成分含量的測定方法對流動相進(jìn)行摸索考查，分別采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1 %磷酸、乙腈-0.1 %冰醋酸、甲醇-1 %醋酸等組分按不同比例進(jìn)樣，結(jié)果顯示采用乙腈-0.1 %磷酸溶液梯度洗脫方式，目標(biāo)峰分離效果最好且峰形對稱，無其他成分干擾。參照《中國藥典》2015年版一部當(dāng)歸、川芎含量測定項(xiàng)下中阿魏酸的有關(guān)要求，結(jié)合DAD檢測器實(shí)際測定的最大吸收波長，最終選取321 nm作為阿魏酸的檢測波長，結(jié)果表明測定時(shí)基線平穩(wěn)，峰形良好，無雜質(zhì)峰干擾。

3.3 含量測定結(jié)果分析 應(yīng)用該方法對4家企業(yè)54批次24個(gè)不同批號的婦康寶口服液樣品進(jìn)行測定，由結(jié)果可見，企業(yè)2、3之間的平均值較為接近。企業(yè)1、和企業(yè)4平均值與之差異較大，表明不同企業(yè)之間產(chǎn)品質(zhì)量存在差異，各企業(yè)在生產(chǎn)工藝或者原料藥材質(zhì)量方面把握程度不一。企業(yè)1、2、4測定結(jié)果最高值和最低值相差較大，說明在生產(chǎn)過程中存在較為嚴(yán)重的不穩(wěn)定因素。因此，建議相關(guān)企業(yè)積極提升原料藥材的質(zhì)量；另外，應(yīng)考查提取工藝參數(shù)對阿魏酸穩(wěn)定性的影響，并規(guī)范生產(chǎn)工藝進(jìn)行生產(chǎn)。分析含量測定結(jié)果差異大的原因可能有以下幾個(gè)方面：①生產(chǎn)中使用的藥材質(zhì)量較差，有效成分含量較低；②未嚴(yán)格按處方量進(jìn)行投料；③生產(chǎn)工藝參數(shù)不合理，未經(jīng)考查驗(yàn)證，藥材中的有效成分未被完全提取出來或被破壞。