向曉燕，余忠姝，謝佳希，施宇濤，張景勍，趙華

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院重慶高校藥物工程研究中心，重慶 400016；2.重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，重慶 401320)

吳茱萸堿(evodiamine，ED)是分離自吳茱萸的一種主要活性生物堿。研究報(bào)道ED能與多靶點(diǎn)相互作用，發(fā)揮廣泛的生物活性，如胃腸道調(diào)節(jié)、心血管保護(hù)等，還能通過(guò)阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制遷移和侵襲等多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤療效，是一種有前景的天然藥物[1]。但是ED的水溶性差、半衰期短、口服生物利用度低等缺陷阻礙了其臨床應(yīng)用[2]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的ED制劑包括復(fù)合物[3]、脂質(zhì)體[4]、納米乳[2]等，這些劑型分別存在改善口服生物利用度效果不明顯、安全性不高等不足，不能很好地滿足需求。因此高效、安全的ED新劑型的研究和開(kāi)發(fā)具有重要意義。

磷脂和環(huán)糊精是安全有效的輔料，用于提高藥物溶解度和透膜能力，兩者同時(shí)與藥物絡(luò)合形成三元體系，顯著改善藥物的溶解性、增強(qiáng)藥物口服吸收[5]。生物相容的天然多糖殼聚糖和透明質(zhì)酸是低毒、可降解的載體材料，殼聚糖陽(yáng)離子可與帶負(fù)電荷的腸黏膜相互作用，打開(kāi)細(xì)胞間隙，促進(jìn)ED吸收[6]；親水性透明質(zhì)酸增加藥物溶解、延長(zhǎng)其血液循環(huán)，也通過(guò)主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞CD44受體，改善藥物在腫瘤部位的積累[7]。殼聚糖和透明質(zhì)酸通過(guò)正負(fù)電荷相互吸引制備聚電解質(zhì)納米粒，用于改善藥物體內(nèi)代謝和分布特征[8]。本研究首先將ED與磷脂、羥丙基-β-環(huán)糊精制成三元復(fù)合物，輔以富勒醇包載，隨后將含藥復(fù)合物包納進(jìn)殼聚糖/透明質(zhì)酸載體外層中，制備了殼聚糖雜化吳茱萸堿復(fù)合納米粒(chitosan hybrid evodiamine composite nanoparticles，CENP)，希望結(jié)合藥物復(fù)合技術(shù)和納米技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，以達(dá)到顯著增加ED水溶性、提高ED的口服生物利用度的效果。通過(guò)考察CENP和ED在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，為ED后續(xù)抗腫瘤研究提供方向，并奠定其臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 ED(含量>99%，武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司)；羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)(含量99.8%，淄博千匯生物科技有限公司)；磷脂(PC)(Lipoid S 100，Phospholipid Gmbh，Nattermannllee，Germany)；殼聚糖(CS)(浙江金殼生物化學(xué)有限公司)；透明質(zhì)酸(HA)(曲阜市廣龍生物制品廠)；CENP(實(shí)驗(yàn)室自制)；和厚樸酚(西安小草植物科技有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)天地有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.1.2儀器 島津LC-20A型液相色譜儀(日本島津公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(型號(hào)：RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠)；電子天平(感量：0.1 mg，型號(hào)：FA1004A，上海精天電子儀器有限公司)；TGL-16B臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；Zetasizer Nano zs90激光粒度電位儀(日本島津公司)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(230±20) g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK-(渝)2017-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(20±2) ℃、相對(duì)濕度(60±10)%、明暗交替12 h/12 h。

1.2方法

1.2.1CENP的制備及表征 采用離子凝膠法制備CENP[9]。稱取處方量ED、羥丙基-β-環(huán)糊精、磷脂溶于乙醇中，水浴中磁力攪拌3.5 h，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去無(wú)水乙醇得淡黃色復(fù)合物。取適量復(fù)合物，將處方量的透明質(zhì)酸溶液、富勒醇溶液逐滴、緩慢加入殼聚糖溶液，磁力攪拌30 min得CENP。取適量CENP，用超純水稀釋10倍，采用馬爾文激光粒度儀測(cè)定其粒徑和Zeta電位。

1.2.2給藥方案及樣品采集 12只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為游離藥ED組和制劑CENP組(n=6)，禁食12 h后，分別灌胃相應(yīng)藥物(劑量均以ED 100 mg·kg-1計(jì))。分別于給藥后5，10，15，30，45 min、1，2，4，6，8，12，24，48，72，96 h采集血樣體積500 μL，隨后6000 r·min-1，離心10 min，后取上清液，-80 ℃凍存，待下一步處理。

1.2.3血漿樣品的處理 取待測(cè)血漿樣品100 μL，加入1 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)和厚樸酚溶液20 μL和乙腈500 μL，3000 r·min-1渦旋1 min，靜置30 s后重復(fù)渦旋1次。將樣品離心(12 000 r·min-1，10 min)取上清液，氮?dú)獯蹈桑S后加入乙腈100 μL復(fù)溶，渦旋30 s，8000 r·min-1，離心5 min，取上清液40 μL進(jìn)樣。

1.2.4色譜條件 色譜柱：COSMOSIL 5C18-MS-II柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：10 mmol·L-1乙酸銨：乙腈=40：60；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm；進(jìn)樣體積：40 μL。

1.2.5方法學(xué)考察 按照“2.4項(xiàng)”下的色譜條件，通過(guò)專屬性、線性關(guān)系、精密度、回收率和穩(wěn)定性等試驗(yàn)，考察ED體內(nèi)含量測(cè)定方法的合理性[10]。

1.2.6數(shù)據(jù)處理 以血藥濃度為縱坐標(biāo)、時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制血藥濃度-時(shí)間曲線。使用DAS2.1.1 版軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算并比較CENP和ED的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.7生物等效性評(píng)價(jià) 采用DAS軟件將AUC(0-∞)和Cmax經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析、單雙側(cè)t檢驗(yàn)和[1-2α]90%置信區(qū)間考察；利用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)考察CENP和ED的tmax，比較CENP和ED的生物等效性。

2 結(jié)果

2.1CENP的粒徑和Zeta電位 CENP的粒徑和Zeta電位分別為(423.90±26.12) nm和(43.47±1.20) mV。

2.2CENP的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) CENP和ED灌胃大鼠后的體內(nèi)藥時(shí)曲線圖見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，CENP的整體血藥濃度水平較ED增加，CENP的Cmax約為ED的3倍，表明CENP增加了ED的口服吸收。CENP的血藥濃度達(dá)峰時(shí)間較ED延遲。當(dāng)ED在給藥后24 h濃度已接近于0時(shí)，CENP仍保持較高濃度值，說(shuō)明CENP延長(zhǎng)了藥物的體內(nèi)滯留時(shí)間，能發(fā)揮更長(zhǎng)時(shí)間的作用。

圖1 大鼠口服CENP和ED后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

CENP和ED的主要藥代參數(shù)結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2。分析非房室模型參數(shù)可知，與ED比較，CENP的AUC(0-∞)和Cmax分別增加了約3.57倍和1.92倍。MRT(0-96 h)增加了約7.59 h，CL降低了78.57%，分析房室模型參數(shù)可知，CENP的AUC(0-∞)和Cmax分別約為ED的4.18倍和2.92倍。與ED比較，CENP的相對(duì)生物利用度AUC(0-∞)在非房室模型和房室模型中分別為457.46%和417.80%，兩種模型分析結(jié)果相差不大。

2.3生物等效性評(píng)價(jià) CENP和ED的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及生物等效性結(jié)果，見(jiàn)表3。由表可知，AUC(0-∞)和Cmax的[1-2α]90%置信區(qū)間分別為(79.9，82.8)%和(78.3，84.6)%，均不在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)；兩者的tmax差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)。綜上所述，CENP和ED生物不等效。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)成功制備殼聚糖雜化吳茱萸堿復(fù)合納米粒CENP，研究其在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。CENP的粒徑為(423.90±26.12) nm，屬于納米范圍。CENP的Zeta電位為(43.47±1.20) mV，> 30 mV，粒子間的反作用力可以避免絮結(jié)和凝集，從而保持CENP的穩(wěn)定性[11]。ED的體內(nèi)含量測(cè)定方法符合要求。藥動(dòng)學(xué)結(jié)果表明，CENP可以明顯改善ED的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為，促進(jìn)ED的口服吸收，減緩藥物的清除，延長(zhǎng)ED的體內(nèi)作用時(shí)間，增加ED的AUC約3.57倍。CENP增加ED的口服生物利用度的原因可能是：ED與磷脂、環(huán)糊精形成三元復(fù)合體系，環(huán)糊精包納ED的同時(shí)，磷脂也部分伸入環(huán)糊精空腔，改善ED的水溶性、穩(wěn)定性和生物膜透過(guò)能力，進(jìn)而促進(jìn)ED的口服吸收[5]；納米載體殼聚糖和透明質(zhì)酸進(jìn)一步提高ED的溶解性和胃腸道吸收，改善藥物釋放行為，同時(shí)延長(zhǎng)ED的體內(nèi)循環(huán)，減緩清除[12]。與文獻(xiàn)[3，13]報(bào)道的磷脂復(fù)合物、環(huán)糊精包合物比較較，CENP改善ED的AUC能力更強(qiáng)。此外，雖然已報(bào)道的ED納米乳分別提高了ED的AUC約3.66和5.30倍[2，14]，略強(qiáng)于CENP提高AUC的能力。但是由于納米乳的形成需要大量的表面活性劑(如泊洛沙姆188、聚山梨酯80、RH40等)，而這些非離子型表面活性劑可能導(dǎo)致溶血、過(guò)敏、神經(jīng)毒性等不良反應(yīng)，使納米乳的臨床應(yīng)用受到了限制[15]。反之，CENP的載體材料具有生物相容性、可降解性和低免疫原性，遞送系統(tǒng)安全性更高，具有應(yīng)用潛力。CENP具有安全有效的特性，它是遞送抗癌藥物的有前景的平臺(tái)，具有通過(guò)以下多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用的潛力：CENP具有EPR效應(yīng)[16]；環(huán)糊精能抑制P糖蛋白(P-gp)改善藥物吸收并減輕耐藥[17]；透明質(zhì)酸具有控釋和主動(dòng)靶向腫瘤的作用[7]；富勒醇具有自由基清除能力，還可以通過(guò)調(diào)控腫瘤微環(huán)境、抑制血管生成等作用增強(qiáng)藥物抗腫瘤療效[18]。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次制備的復(fù)合納米粒CENP是可改善ED藥動(dòng)學(xué)行為的新制劑，為提高ED生物利用度的劑型研究提供了一定的參考依據(jù)，同時(shí)也為后續(xù)體內(nèi)外研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

表1 大鼠單劑量口服CENP和ED的非房室模型藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

表2 大鼠單劑量口服CENP和ED后的房室模型藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

表3 大鼠單劑量口服CENP和ED的生物等效性評(píng)價(jià)

(志謝：本實(shí)驗(yàn)在重慶醫(yī)科大學(xué)重慶高校藥物工程研究中心完成，在此真誠(chéng)感謝實(shí)驗(yàn)室的所有老師和同學(xué)。)