唐子豪 宗春琳 張維文 趙路 田磊 李德超

大約75%頭頸癌患者需行放射治療［1］，在頭頸部放療并發(fā)癥中，放射性頜骨骨壞死（ORNJ）是最難治的遠期并發(fā)癥之一。ORNJ可導致皮膚和黏膜潰爛、死骨暴露等，給患者帶來巨大痛苦。目前ORNJ發(fā)病機制不清、仍缺乏有效的預防及治療方法。針對ORNJ發(fā)病機制，尋找有效的預防及治療方法，具有重要意義。

自2004年Delanian等［2］提出放射誘導組織萎縮觀點后，近些年來，越來越多學者認同ORNJ是一種放射誘導的纖維化疾?。?］。大量文獻及本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，放療后頜骨局部骨髓間充質干細胞（BMSCs）受損，導致其成骨分化能力下降，并出現(xiàn)肌成纖維細胞（MFB）表型、向成纖維化方向分化，這有可能是導致ORNJ的重要發(fā)病機制之一［4－6］。

BMP-2的成骨能力得到廣泛公認［7］，放射線可抑制BMP-2的表達［8］，外源性使用BMP-2可增強放射性頜骨骨壞死的成骨能力［9］。在胰腺等其他器官纖維化疾病的研究中，發(fā)現(xiàn)BMP-2有減輕纖維化的作用并且這一作用可能與抑制TGFβ1/Smads通路的表達有關［10］，但是在 ORNJ中，BMP-2是否可以抑制放射損傷后BMSCs向成纖維方向分化，尚未見報道。本研究通過檢測放射損傷的BMSCs使用BMP-2干預后，成纖維相關蛋白分子的變化情況，探究BMP-2對放射線損傷的 BMSCs的保護作用，并初步探討 TGFβ1/Smad通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 大鼠BMSCs來源與培養(yǎng)

BMSCs原代細胞取自于2～3周齡的SD大鼠，麻醉后，無菌條件取出脛骨，使用含有10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)液沖洗骨髓，于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至3～6代用于實驗。

1.2 大鼠BMSCs鑒定

成骨與成脂分化誘導：培養(yǎng)細胞加入成骨誘導液誘導21 d后，進行茜素紅染色。培養(yǎng)細胞加入成脂誘導液誘導18 d后，進行油紅O染色。

細胞表面抗體檢測：選取長勢良好、形態(tài)均一的P4代 BMSCs，加入 CD29-PerCP、CD45-FITC、CD90-PE-CyTM7單克隆抗體，制成單細胞懸液后使用流式細胞儀檢測。

1.3 細胞模型建立

采用課題組前期的建模方法進行［11］。使用放射線對BMSCs進行照射，放射源為咸陽第二一五醫(yī)院放療科CX576型放射治療機（VARIAN，美國），射線性質為高能X射線，設置射線能量為6 MeV，劑量率為4 Gy/min，單次劑量為 4 Gy。

1.4 細胞的分組、誘導

為選出BMP-2最佳劑量，對放射后BMSCs分別使用25、50、100、250 ng/mL的 BMP-2，作用 7 d，并使用 Western blot檢測其 α-SMA的表達［12］。

將BMSCs分為對照組、放射組、BMP-2組、BMP-2＋頭蛋白（Noggin）組。對照組不接受放射線照射；放射組使用4 Gy放射線照射；BMP-2組在使用4 Gy放射線照射后使用100 ng/mL BMP-2作用7 d；BMP-2＋Noggin組在BMP-2組基礎上增加200 ng/mL的BMP-2拮抗劑Noggin（PrimeGene，上海）。使用Western Blot檢測各組α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Col-Ⅲ、TGF-β1、Smad2/3、pSmad2/3的表達；使用免疫熒光檢測Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達；使用RT-PCR檢測α-SMA的表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

用GraphPad Prism進行數(shù)據(jù)分析，student-t檢驗進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 BMSCs的鑒定

培養(yǎng)的BMSCs（圖1A），成脂誘導后脂肪細胞形成，累計脂滴呈串珠狀，油紅O染色呈鮮紅色（圖1B）；成骨誘導后可見茜素紅染色礦化結節(jié)呈紅色（圖1C）；流式細胞儀檢測結果顯示BMSCs中CD29、CD90表達陽性率分別為100%、99.9%，而 CD45陽性率0.8%（圖1D）。

A：BMSCs形態(tài)（×40）；B：油紅O染色（×200）；C：茜素紅染色（×40）；D：流式細胞儀檢測圖1 體外培養(yǎng)的BMSCs的鑒定A：BMSCs morphology（×40）；B：Oil red O staining（×200）；C：Alizarin red staining（×40）；D：Flow cytometry analysisFig 1 Identification of in vitro cultured BMSCs

2.2 BMP-2作用劑量測定

Western blot檢測不同濃度BMP-2作用后放射損傷BMSCs中α-SMA的表達，發(fā)現(xiàn)100 ng/mL的BMP-2作用后，α-SMA表達量最低，且與對照組相比，P＜0.05（圖 2）。

圖2 BMP-2對BMSCs中α-SMA表達的影響Fig 2 The effect of BMP-2 on α-SMA expression in BMSCs

2.3 成纖維相關蛋白分子的表達變化

Western blot結果表明，放射組BMSCs中α-SMA、Col-Ⅲ表達量高于對照組，BMP-2組表達量與放射組相比顯著降低（P＜0.05）；BMP-2＋Noggin組表達量與放射組無統(tǒng)計學差異（圖3）。

圖3 Western blot檢測各組細胞中α-SMA和Col-Ⅲ的表達Fig 3 Western blot analysis of α-SMA and col-Ⅲ expression in BMSCs of the groups

免疫熒光方法檢測各組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達，結果顯示放射組Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的表達均顯著高于對照組（P＜0.01），BMP-2組 Col-Ⅰ和 Col-Ⅲ的表達顯著低于放射組（P＜0.01）、與對照組相比無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），BMP-2＋NOGGIN組Col-Ⅰ和 Col-Ⅲ的水平顯著高于BMP-2組（P＜0.01）、而與放射組相比無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖 4）。

圖4 免疫熒光法測量Col-Ⅰ和Col-ⅢFig 4 Immunofluorescence for measuring Col-Ⅰ and Col-Ⅲ expression in BMSCs of the groups

RT-PCR結果表明，放射后 α-SMA擴增倍數(shù)升高，BMP-2組α-SMA擴增倍數(shù)較放射組顯著降低（P＜0.05），BMP-2＋NOGGIN組 α-SMA擴增倍數(shù)高于BMP-2組（圖 5）。

圖5 RT-PCR法測量各組BMSCs中α-SMA的表達Fig 5 α-SMA expression in BMSCs of the groups examined by RT-PCR

2.4 TGF-β1/Smad通路的表達變化

Western blot檢測結果表明，如圖6所示，BMP-2組中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3表達量均較放射組降低（P＜0.05），BMP-2＋Noggin組中 TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3表達量與放射組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖6）。

圖6 Western blot法檢測各組BMSCs中TGF-β1/Smad相關蛋白表達量Fig 6 Western blot analysis of TGF-β1/Smad pathway related protein expression in BMSCs of the groups

3 討 論

ORNJ是頭頸癌患者放療后常見的一種遠期并發(fā)癥，治療棘手、發(fā)病機制不清，目前大量的研究認為，ORNJ是一種放射誘導的纖維化疾病，與放射損傷后局部組織內干細胞受損、成骨能力下降以及纖維化基質堆積有關。有研究表明，應用BMP-2對ORNJ具有一定的治療作用并且與促進ORNJ病變組織內成骨分化有關，而BMP-2在一些其他纖維化疾病如胰腺纖維化等中，可抑制纖維化的形成，從而對纖維化疾病具有一定的治療作用［10］。但是，BMP-2對ORNJ的治療是否與抑制纖維化有關，目前尚未見研究報道。因此，本研究通過建立BMSCs放射損傷模型，檢測BMP-2作用后纖維化相關分子以及TGF-β1/Smads通路的表達變化情況，以明確BMP-2對放射損傷BMSCs成纖維分化的抑制作用，并初步探討其可能的機制。

BMP-2在肺等其他組織纖維化疾病中能夠抑制α-SMA的表達，減輕纖維化［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，使用BMP-2作用于放射后 BMSCs，可顯著降低 α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達，表明BMP-2可抑制放射損傷BMSCs向成纖維化分化、減少放射后細胞外基質的堆積，這可能是BMP-2治療ORNJ的重要機制之一。

近年越來越多的研究表明，TGF-β1在纖維化進程中起到重要作用，已成為公認的器官纖維化治療靶標［14］。有研究表明，在腎的炎癥、纖維化反應中，BMP-2可通過抑制Smad2/3磷酸化而拮抗TGF-β1的作用，最終抑制腎臟纖維化［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2可明顯抑制放射損傷BMSCs中TGF-β1及p-Smad2/3的表達，表明BMP-2抑制放射損傷BMSCs的成纖維化能力，可能與TGF-β1/Smad途徑相關。

通過本研究，發(fā)現(xiàn)BMP-2可抑制放射損傷BMSCs中的纖維化相關分子、TGF-β1及其下游分子的表達。由此推測，BMP-2除了可增強放射損傷后BMSCs的成骨分化能力，還可能通過抑制TGF-β1/Smad信號通路從而減輕其向成纖維方向分化。本研究進一步闡明了BMP-2在ORNJ治療中的機制，可為提高BMP-2對ORNJ的治療效果提供理論依據(jù)。僅管BMP-2在體外培養(yǎng)的放射損傷BMSCs中具有抗纖維化作用，但BMP-2在ORNJ組織中抗纖維化的具體機制并不清楚，還需要通過更多的體內外實驗進一步研究BMP-2在ORNJ中的抗纖維化作用。