楊瑤瑤 袁文紅 張倩倩 宋宇 曲雅馨 于艷玲

種植義齒因其良好的功能及美學(xué)效果被認(rèn)為是缺牙患者的首選修復(fù)方式。盡管種植手術(shù)取得了長足的發(fā)展，但在一些特殊人群如骨質(zhì)疏松患者中表現(xiàn)欠佳，骨質(zhì)疏松患者骨小梁和骨密度較低，極易導(dǎo)致種植失敗［1］，如何提高骨質(zhì)疏松患者種植修復(fù)效果是口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的難題。

種植體表面形貌處理改善骨結(jié)合效果是一種很有潛力的方法。大量文獻(xiàn)表明將鈦植體表面處理成TiO2納米管形貌能夠提高蛋白和細(xì)胞的粘附從而更好地促進(jìn)骨結(jié)合［2］。有學(xué)者提出納米管管狀結(jié)構(gòu)可作為一種優(yōu)良的載體，遞送離子、藥物等［3－4］促進(jìn)骨結(jié)合。鍶 （Sr）元素已被證明具有促進(jìn)新骨形成和抑制破骨吸收的雙重作用，廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的臨床治療［5］。鈷 （Co）元素能夠穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）并激活靶基因VEGF模擬體外低氧環(huán)境來增強(qiáng)血管生成［6］，本實(shí)驗(yàn)將種植體表面處理成納米管結(jié)構(gòu)，水熱法分別加載鍶、鈷元素，構(gòu)建5種不同形貌，即光滑組（smooth titanium，ST）、納米組（nano titanium，NT）、納米鍶組（nano titanium-strontium，NT-Sr）、納米鈷組（nano titaium-cobalt，NT-Co）、納米鍶鈷組（nano titanium-strontium-cobalt，NT-Sr-Co），探究將具有促進(jìn)成骨作用和促進(jìn)血管新生作用的兩種元素結(jié)合能否更好地促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠的骨結(jié)合。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

3月齡雌性SD大鼠（濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司）；99.99%純鈦鈦片、純鈦種植體（東莞市升躍精密五金制品有限公司）；氯化鍶、氯化鈷（阿拉丁，美國）；馬弗爐（天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司）；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（ZEISS Sigma 300，德國）；X射線光電子能譜儀（ThermoFisher，美國）；micro-CT（μCT-100，德國）；EXAKT 300 CP/400CS/AW 硬組織切磨系統(tǒng)（EXAKT，德國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同形貌材料的制備及觀察 直徑14 mm×1 mm的圓形鈦片逐級(jí)拋光、超聲清洗后置于1.25 wt%的氫氟酸溶液中20 V電壓下陽極氧化1 h制備TiO2納米管形貌，經(jīng)馬弗爐400℃、2 h退火處理，配置0.02 mol/L的 Sr溶液和0.001 mol/L的 Co溶液于200℃、4 h條件下進(jìn)行水熱反應(yīng)，構(gòu)建5組形貌：ST組，NT組，NT-Sr組，NT-Co組，NT-Sr-Co組，分別采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察和 X射線光電子能譜儀（XPS）分析。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立 實(shí)驗(yàn)選取35只3月齡SD大鼠（180±15）g，遵照青島市口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)定置于無菌動(dòng)物房中飼養(yǎng)，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（30只）和對(duì)照組（5只），實(shí)驗(yàn)組采用雙側(cè)卵巢摘除術(shù)（OVX）建立骨質(zhì)疏松模型，對(duì)照組即假手術(shù)組僅打開腹腔摘除部分脂肪。3個(gè)月后進(jìn)行微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（micro-CT）檢測(cè)骨質(zhì)疏松模型是否構(gòu)建成功。

1.2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 模型大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只。將直徑2 mm×4 mm的純鈦種植體按相同工藝制備成5組不同形貌，無菌操作下分別植入5組大鼠雙側(cè)股骨干骺端，每側(cè)股骨植入1顆種植體，每只大鼠植入同種種植體。術(shù)后3 d連續(xù)肌注抗生素。4周后對(duì)大鼠實(shí)行安樂死，切取含有種植體的股骨，浸于4%多聚甲醛中備用。

1.2.4 micro-CT掃描 μCT-100顯微 CT以種植體為軸心，向周圍骨展開約2 mm進(jìn)行掃描和三維重建。掃描參數(shù)為：電壓70 kV，電流200μA，分辨率14.8 μm，曝光時(shí)間：300 ms，對(duì)骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁間隙（Tb.Sp）進(jìn)行定量分析。

1.2.5 甲苯胺藍(lán)染色 EXAKT 300 CP/400CS/AW硬組織切磨系統(tǒng)制備約50μm厚不脫鈣種植體－骨組織磨片，甲苯胺藍(lán)染色后中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下采集圖像并測(cè)量計(jì)算骨接觸率（bone implant contact，BIC）。

2 結(jié) 果

2.1 材料學(xué)表征觀察

SEM：ST組表面接近平坦，可見少量微坑狀拋光劃痕；NT組則呈現(xiàn)蜂窩狀、管壁均勻，規(guī)則一致的納米管結(jié)構(gòu)，管徑約為80～85 nm左右（圖1）。

圖1 ST組和NT組掃描電鏡圖Fig 1 SEM images of ST group and NT group

XPS：各組Ti和O光譜均對(duì)應(yīng)經(jīng)典峰值（圖2）。NT-Sr組除顯示Ti和O外，還包含Sr的峰值，結(jié)合能為133.34 eV；NT-Co組出現(xiàn)了Co的特征峰，結(jié)合能為780.13 eV；NT-Sr-Co組則同時(shí)擁有Sr和Co兩個(gè)特征峰，表明水熱反應(yīng)成功負(fù)載Sr和Co元素。

圖2 NT-Sr組、NT-Co組、NT-Sr-Co組表面元素能譜圖Fig 2 Surface element energy spectra of NT-Sr group，NT-Co group and NT-Sr-Co group

2.2 micro-CT掃描骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型

圖3為OVX組和假手術(shù)組大鼠股骨的micro-CT剖面圖，OVX組骨密度明顯降低，說明骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型構(gòu)建成功，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖3 OVX術(shù)后2組股骨剖面圖Fig 3 Section view of femurs in 2 groups after OVX

2.3 micro-CT掃描種植體－骨組織

4周后種植體周圍三維重建圖見圖4，NT-Sr組、NT-Co組、NT-Sr-Co組3組間定量分析結(jié)果見圖 5，NT-Sr組和NT-Sr-Co組以及NT-Co組和NT-Sr-Co組間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而 NT-Sr組和 NTCo組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖4 4周后種植體周圍新生骨情況（micro-CT）Fig 4 New bone formation around the implant4 weeks after implantation（micro-CT）

圖5 5組骨組織參數(shù)Fig 5 Bone tissue parameters of the 5 groups

2.4 組織學(xué)觀察

光鏡下可以清晰地觀察到4周時(shí)種植體明顯被新生骨包圍，在磨片上顯示為深藍(lán)色，黑色部分為種植體（圖 6）。選擇感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）計(jì)算種植體骨結(jié)合率（BIC%），NT組顯著高于ST組（P＜0.01），NT-Sr組顯著高于 NT組（P＜0.01），NT-Co組高于NT組（P＜0.05），NT-Sr-Co組顯著高于 NT-Sr組和NT-Co組（P＜0.01），而NT-Sr組與NT-Co組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用 Graphpad 8.0繪圖軟件，對(duì)不同分組間進(jìn)行單因素方差分析，同一組間進(jìn)行多重比較，P＜0.05時(shí)認(rèn)為有差異；P＜0.01時(shí)認(rèn)為有顯著性差異。

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥是一種影響數(shù)百萬人的代謝性疾病，患有骨質(zhì)疏松患者的種植成功率明顯降低，鈦植體的表面形貌能夠顯著影響成骨細(xì)胞的粘附，增殖和分化［7］。若能通過種植體表面處理提高骨結(jié)合能力則是一種很有前途的方法。TiO2納米管結(jié)構(gòu)因能明顯改善骨結(jié)合效果和具有載體功能成為近幾年的研究熱點(diǎn)［8］。先前的研究證明，鍶（Sr）具有促進(jìn)骨骼形成和減少骨吸收的雙重作用［9］，鈷（Co）具有促進(jìn)血管新生的作用［10］，但鈷離子過量摻入會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性［11］。因此本研究嘗試通過陽極氧化法和水熱反應(yīng)法制備一種新型多功能的Sr、Co共摻雜納米管種植體，評(píng)估兩者結(jié)合對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨結(jié)合的影響。

通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)本研究發(fā)現(xiàn)4周后5組中NT-Sr-Co組骨結(jié)合率最高，說明新制備的載鍶、鈷納米管種植體有效改善了骨質(zhì)疏松大鼠的骨整合效果。各項(xiàng)定量分析數(shù)據(jù)也支持這種變化。骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）是反映骨骼重塑的最重要的參數(shù)，NT-Sr-Co組的骨體積分?jǐn)?shù)相對(duì)于光滑組組增加了約1.9倍，說明NT-Sr-Co組的骨量增加了約1.9倍；BV/TV的顯著性差異還被發(fā)現(xiàn)在NT-Sr-Co組和NT-Co組之間（P＜0.01），說明Sr能夠明顯改善種植體骨結(jié)合。4周后甲苯胺藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)種植體周圍均為新生骨小梁包繞，骨質(zhì)連續(xù)且與基骨之間分界明顯。圖7結(jié)果顯示與ST組比較，NT組骨結(jié)合率顯著升高（P＜0.01），說明將種植體表面處理成TiO2納米管結(jié)構(gòu)能夠改善骨整合，與Lavenus等［12］研究結(jié)果一致。與NT組相比，NT-Sr組骨結(jié)合率顯著提高（P＜0.01），說明Sr元素的加入能夠明顯增強(qiáng)骨質(zhì)疏松大鼠的骨結(jié)合，文臣娟等［13］將鍶摻入透鈣磷石中，發(fā)現(xiàn)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨功能有促進(jìn)作用。Liang等［14］將鍶元素加載到鈦植體表面，也證明了鍶元素能夠明顯促進(jìn)骨整合，NT-Co組與NT組也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說明Co元素的摻雜相比未摻雜組NT組也改善了骨結(jié)合率，但作用力不如Sr元素明顯，可能原因是Co元素僅在促進(jìn)血管生成方面發(fā)揮作用，但對(duì)成骨細(xì)胞的作用不那么明顯，具體機(jī)制我們還在探究中。但有文獻(xiàn)報(bào)道Co除了誘導(dǎo)血管生成外，也表現(xiàn)出了成骨刺激作用［15－17］，而NT-Sr-Co組相比 NT組具有顯著性差異（P＜0.01），說明Sr和Co元素的單獨(dú)摻雜都能促進(jìn)骨結(jié)合，Sr摻雜能夠?qū)е赂玫墓切纬桑珻o的改善作用遠(yuǎn)小于Sr，但當(dāng)Sr、Co共摻雜時(shí)即可發(fā)揮良好的生物功能，可能是Co元素產(chǎn)生了協(xié)同作用，致使NT-Sr-Co組的骨結(jié)合率在5組中是最高的。

圖7 5組BIC統(tǒng)計(jì)圖Fig 7 BIC statistics of the 5 groups

綜上所述，與傳統(tǒng)的光滑Ti相比，TiO2納米管結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)骨結(jié)合，Sr元素能夠明顯改善種植體周圍骨結(jié)合，Co元素也能在一定程度上改善骨結(jié)合，但效果不如Sr明顯。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的NT-Sr-Co種植體通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明誘導(dǎo)了更多的新骨生成和更緊密的骨結(jié)合，為需要種植手術(shù)的骨質(zhì)疏松患者提供了一種新策略，具有巨大的牙科和骨科應(yīng)用潛力。