魏瑩瑩，胡翔宇，祖麗皮耶·艾爾肯，龔衛(wèi)娟，賈筱琴

揚州大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學系，江蘇 揚州 225001

microRNA（miRNA）是一類內生的、長度約為20～24個核苷酸的非編碼RNA，不僅參與細胞增殖、發(fā)育、分化、凋亡等基本生理過程，還和腫瘤、炎癥等病理過程有著密切關系［1］。miR-16和miR-15a基因復合體定位于人類基因組13q14，該位點基因的突變與慢性淋巴細胞性白血病以及黑色素瘤、結直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等多種實體腫瘤，有著密切的關系［2］。miR-16/miR-15a可以直接靶向多種致癌基因，也可以靶向抑制生長因子的分泌，從而發(fā)揮抗腫瘤活性［3-4］。

NKG2D 是表達于自然殺傷（natural killer，NK）和CD8+T細胞的重要活化性受體之一［5］。NKG2D轉錄后水平可受miRNA調控，如miR-182可與NKG2D的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）結合下調NKG2D 表達［6］。通過生物信息學分析，我們在小鼠NKG2D 基因3′-UTR 區(qū)發(fā)現(xiàn)了miR-16 結合的互補基因區(qū)（圖1），然而miR-16 是否通過調節(jié)NK 細胞NKG2D 的表達進而參與腫瘤的調控，目前尚不清楚。

圖1 miR-16與NKG2D 3′-UTR的互補序列Figure 1 Complementary sequence of miR-16 and NKG2D 3′-UTR

本研究觀察了MC38 結腸癌移植瘤在8 周齡miR-16/15a-/-小鼠體內的生長情況，以及生理及荷瘤狀態(tài)下NKG2D+NK 細胞和NKG2D-NK 細胞內miR-16表達的變化。同時利用miR-16/15a-/-小鼠研究生理及荷瘤后NK細胞的活性變化，為深入了解miR-16調節(jié)NK細胞生物學活性提供重要實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細胞系

miR-16/15a-/-小鼠為本實驗室自美國Jackson實驗室引進，并于揚州大學比較醫(yī)學中心繁殖，C57BL/6 小鼠購自揚州大學比較醫(yī)學中心，所有使用實驗動物均為8 周齡。飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度20～25 ℃，濕度50%左右，正常晝夜更替，12 h 光照/12 h無光照交替進行的方式模擬，自由飲水進食。所有動物實驗嚴格按照動物實驗規(guī)范執(zhí)行。飼養(yǎng)小鼠結腸癌細胞系MC38 細胞株和小鼠淋巴瘤細胞（YAC-1細胞）由本實驗室常規(guī)保存。

1.1.2 主要試劑

RNA 逆轉錄試劑盒Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit、DNA 合成酶SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa公司，日本）；APC-NK1.1抗體（PK136）、PENKG2D抗體（6d5）、FITC-CD3抗體（17A2）、PE-IFNγ抗體（XMG12）（BioLegend公司，美國）；PE-CD107a抗體（1D4B）（BD Biosciences 公司，美國）；佛波脂醇和離子霉素刺激劑（eBioscience公司，美國），DMEM細胞培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國）；胰酶細胞消化液、紅細胞裂解液（上海碧云天）；胎牛血清（Biological Industries 公司，以色列）；DNase Ⅰ（上海生工）；DispaseⅡ（Roche Applied Science 公司，美國）；膠原酶Ⅳ（Sigma公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 觀察miR-16/15a-/-小鼠對結腸癌移植瘤的敏感性

收集對數(shù)期小鼠結腸癌MC-38細胞按2×106個/只皮下注射miR-16/15a-/-小鼠（KO）和同型對照C578L/6 小鼠（WT）。每天觀察移植瘤生長情況和小鼠狀態(tài)，體外測量移植瘤長、寬、高并計算體積。第21天時取出移植瘤和小鼠脾臟，進行下一步分析。

1.2.2 RT-PCR法檢測小鼠NK細胞miR-16的表達

分離C57BL/6 小鼠脾臟并制備淋巴單細胞懸液，通過BD流式細胞儀分選NK1.1+NKG2D+細胞和NK1.1+NKG2D-細胞，用TRIzol 分別提取各組細胞總RNA，分光光度計測量其純度及濃度，并取1 μg，采用Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit逆轉錄成cDNA，逆轉錄條件為37 ℃60 min，85 ℃5 min。然后，以cDNA 為模板，進行熒光定量PCR，反應條件為95 ℃10 s；95 ℃5 s，60 ℃20 s，40 個循環(huán)。熒光定量PCR 采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，設計上游引物miRNA-16-1 序列為5′-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3′，下游引物為試劑盒的通用引物。以snRNA 中的U6 作為內參基因，其上下游通用PCR 引物均由試劑盒提供。結果采用相對定量方法對目的基因的表達量進行分析，實驗重復3 次。

1.2.3 流式細胞術檢測miR-16/15a-/-小鼠NK 細胞的表型和功能

分離8 周齡的miR-16/15a-/-小鼠和同型對照小鼠的脾臟并制備淋巴單細胞懸液，通過流式細胞術分別檢測CD3-NK1.1+和CD3-NK1.1+NKG2D+細胞頻率。用流式細胞術進行胞內染色時，用細胞刺激劑體外培養(yǎng)淋巴細胞4 h 后，Brefeldin A 阻斷轉運和釋放，標記NK1.1 和IFN-γ抗體，檢測NK 細胞分泌的IFN-γ。另外，用脾臟單細胞懸液按3∶1、1∶1、1∶3 的效-靶比例，分別與小鼠淋巴瘤細胞（YAC-1細胞）共孵育后，以CD107a 標記法檢測NK 細胞的脫顆粒活性。

1.2.4 流式細胞術分析NK細胞在荷瘤小鼠組織中的分布

取脾臟淋巴單細胞懸液，流式細胞術分析脾臟中NK 細胞頻率和NK 細胞及其受體NKG2D 的表達。對于分離的腫瘤組織，充分研磨后用0.5 mg/mL的膠原酶Ⅳ、0.5 mg/mL的DnaseⅠ和3 mg/mL的DispaseⅡ消化腫瘤組織，梯度離心法獲得腫瘤浸潤樣淋巴細胞，流式分析腫瘤組織中NK 細胞頻率及NKG2D表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 7 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均值±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-16/15a-/-小鼠對結腸癌移植瘤的敏感性

miR-16/15a-/-小鼠（KO）和對照小鼠（WT）經(jīng)皮下注射MC38 細胞制備結腸癌移植瘤模型，觀察兩組小鼠皮下實體瘤生長情況。結果顯示，與WT 小鼠比較，移植瘤的生長在KO小鼠受到顯著抑制（圖2A、B），KO 組小鼠腫瘤重量明顯小于WT 小鼠（P＜0.05，圖2C）。

圖2 miR-16/15a-/-小鼠對結腸癌移植瘤敏感性的檢測Figure 2 Sensitivity of miR-16/15a-/-mice to colon cancer xenograft

2.2 生理及荷瘤狀態(tài)下miR-16在NK1.1+NKG2D+細胞的表達

已知miRNA［7］，包括miR-16/15a調節(jié)NK細胞的分化與功能［8］，NK 細胞異常表達NKG2D 會影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［9］，于是課題組研究miR-16 水平與NK 細胞NKG2D 表達的關系。分別取生理狀態(tài)的C57BL/6 小鼠和荷瘤（MC38 皮下荷瘤）3 周的C57BL/6 小鼠的脾臟細胞，流式細胞術分選脾臟NK1.1+NKG2D+細胞和NK1.1+NKG2D-細胞，RT-PCR法檢測miR-16的表達。結果顯示，生理狀態(tài)小鼠脾臟NK1.1+NKG2D+細胞中miR-16表達水平較NK1.1+NKG2D-細胞顯著降低（P＜0.01，圖3A），荷瘤小鼠脾臟NK細胞miR-16的表達在NKG2D+和NKG2D-亞群中無明顯變化（P＞0.05，圖3B），提示荷瘤狀態(tài)下，miR-16對NK細胞NKG2D的表達無明顯調控作用。

圖3 生理或荷瘤小鼠NK1.1+NKG2D+和NK1.1+NKG2D-細胞miR-16的表達Figure 3 Expression of miR-16 in NK1.1+NKG2D+ and NK1.1+NKG2D- cells in physiological or tumorbearing conditions

2.3 miR-16/15a-/-小鼠NK 細胞頻率及受體NKG2D的表達

接下來課題組研究miR-16/15a敲除后，NK細胞頻率及NK細胞NKG2D的表達是否發(fā)生改變。流式細胞術分析生理狀態(tài)下miR-16/15a-/-小鼠和對照小鼠脾臟NK細胞百分率，同時檢測NK細胞NKG2D的表達情況。結果顯示兩組小鼠脾臟中NK細胞百分率和NK細胞NKG2D的表達均無顯著差異（P＞0.05，圖4A、B）。進一步用IL-2（20 ng/mL）+IL-15（20 ng/mL）聯(lián)合刺激NK 細胞活化72 h 后，兩組小鼠NK 細胞NKG2D的表達亦無明顯變化（P＞0.05，圖4C）。

圖4 miR-16/15a-/-小鼠脾臟NK細胞頻率及NKG2D的表達Figure 4 NK cell frequency and expression of NKG2D in the spleen of miR-16/15a-/-mice

2.4 miR-16/15a-/-小鼠NK細胞IFN-γ分泌和細胞毒活性的檢測

流式細胞術分析生理狀態(tài)的miR-16/15a-/-小鼠和同型對照小鼠脾臟NK細胞IFN-γ的產(chǎn)生能力，以及與靶細胞共孵育后的脫顆?；钚裕栽u估NK 細胞殺傷活性。結果表明，與WT 小鼠相比，KO 小鼠NK 細胞分泌IFN-γ的能力無顯著變化（P＞0.05，圖5A）；同時兩組小鼠NK細胞脫顆粒能力（CD107a表達）無明顯差異（P＞0.05，圖5B）。

圖5 miR-16/15a-/-小鼠脾臟NK細胞IFN-γ產(chǎn)生和脫顆粒活性的檢測Figure 5 IFN-γ production and degranulation activity of NK cells in the spleen of miR-16/15a-/-mice

2.5 miR-16/15a-/-小鼠荷瘤后體內NK 細胞活性的檢測

以MC38 細胞皮下注射miR-16/15a-/-小鼠和C57BL/6小鼠，建立小鼠結腸癌移植瘤模型，對兩組荷瘤小鼠用流式細胞術分析脾臟和移植瘤中NK細胞及NK1.1+NKG2D+細胞的百分率。結果表明，無論是NK 細胞的百分率，還是NK1.1+NKG2D+的百分率，在兩組荷瘤小鼠的脾臟（P＞0.05，圖6A、B）和移植瘤中都沒有明顯的差異（P＞0.05，圖6C、D），提示荷瘤狀態(tài)下miR-16對NK細胞表達NKG2D及NK細胞的生物學功能無明顯調節(jié)作用。

圖6 荷瘤小鼠脾臟和移植瘤組織NK細胞的檢測Figure 6 Detection of NK cells in spleen and transplanted tumor of mice

3 討論

miR-16/miR-15a功能下降和缺失不僅與慢性B淋巴細胞性白血?。s55%）密切相關，還與黑色素瘤、結直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等多種實體腫瘤有關［2］。miR-16/miR-15a 主要靶向抑制Bcl-2、WT-1、WNT3A、MCA1、MCL1、CCDN1等致癌基因的活性，進而促進腫瘤細胞的凋亡［3］。同時研究證實敲除miR-16/miR-15a 抑制肝癌（H22）移植瘤的生長［10］，過表達miR-16/miR-15a會促進結腸癌（MC38）移植瘤的生長［11］，miR-16或miR-15a在淋巴細胞中的表達以及其對淋巴細胞活性的影響還有待進一步研究。Sullivan等［8］發(fā)現(xiàn)在小鼠NK細胞中miR-16/15a可以直接靶向轉錄因子c-myb的3′-UTR區(qū)，從而影響NK 細胞的成熟和分化。本研究通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)NKG2D基因的3′-UTR區(qū)也存在miR-16的互補結合序列，而NKG2D是NK細胞表面重要的活化性受體，那么miR-16 是否參與調控NK 細胞NKG2D 的表達，以及其對NK 細胞介導的抗腫瘤免疫活性的影響如何，這對了解miR-16在不同狀態(tài)NK細胞的表達特點及其活性調節(jié)具有重要意義，值得進一步研究。NKG2D 不僅是NK 細胞表面重要的活化性受體，也是CD4+T、CD8+、NKT、?δT以及部分巨噬細胞表面的活化性受體。當NKG2D與其配體MHC Ⅰ類相關分子（MICA 或MICB）結合后，激活NK 和CD8+T 淋巴細胞，成為機體發(fā)揮抗腫瘤和抗感染活性的關鍵免疫分子［5，12］。NKG2D+CD8+T、NKG2D+CD4+T細胞通常聚集腫瘤部位，發(fā)揮抗腫瘤作用［13］，而miR-16/15a 能夠影響NKG2D+CD8+T［14］、NKG2D+CD4+T［11］細胞的頻率。提示miR-16/15a也可能通過影響CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞等NKG2D的表達發(fā)揮抗腫瘤作用。

為了進一步研究miR-16/15a 的生物學功能，課題組從美國Jackson 實驗室引進了miR-16/15a 基因敲除小鼠。對比WT小鼠，miR-16/15a-/-小鼠的肝癌（H22）移植瘤生長速度變慢［11］。課題組對miR-16/15a-/-小鼠皮下注射MC38細胞，miR-16/15a-/-小鼠結腸癌移植瘤的生長速度較野生小鼠明顯降低，提示miR-16/15a-/-小鼠抗腫瘤活性增強。生理狀態(tài)下，與NK1.1+NKG2D-細胞相比，C57BL/6 小鼠NK1.1+NKG2D+細胞miR-16 表達明顯下降，提示miR-16 可能調節(jié)NK 細胞NKG2D 的表達。然而在荷瘤小鼠中，miR-16 在小鼠脾臟2 組NK 細胞亞群間的表達差異消失，提示對于荷瘤小鼠的NK細胞，miR-16對其NKG2D表達沒有核心調控作用。另外，生理狀態(tài)的miR-16/15a-/-小鼠體內NK細胞百分率、活性和細胞毒性與對照小鼠無顯著差異，與NK 細胞特異性缺乏miR-16/15a 的報道相一致。以上結果均提示盡管miR-16可能參與NK細胞NKG2D表達的調控，但對NK細胞的生物學活性無明顯調節(jié)作用。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，NK 細胞及NK1.1+NKG2D+細胞的百分率在荷瘤組織和脾臟內均無明顯變化，說明NK細胞在miR-16/15a基因敲除小鼠體內的腫瘤監(jiān)視作用改變不明顯，可能是其他免疫細胞介導了抗腫瘤活性。課題組前期研究提示，miR-16/15a-/-小鼠荷瘤后，其腫瘤微環(huán)境中M1 型巨噬細胞的百分率明顯增加，其M1 細胞的分化主要依賴NF-κB 和STAT3通路的共同激活［10］。另外，活化的小鼠CD8+T細胞表達NKG2D，且miR-16在初始CD8+T細胞中高表達，CD8+T細胞活化后表達下調［15］。因此，miR-16缺陷是否直接導致CD8+T細胞、M1型巨噬細胞活性上調，進而發(fā)揮抗腫瘤作用，需要后續(xù)進一步的實驗證實。

綜上所述，miR-16/15a-/-小鼠抑制MC38 結腸癌移植瘤生長。盡管生理狀態(tài)下miR-16在NKG2D+和NKG2D-NK 細胞表達存在明顯差異，但是正常和荷瘤狀態(tài)下miR-16/15a-/-小鼠的NK 細胞卻無明顯區(qū)別。因此miR-16/15a-/-小鼠抑制MC38 結腸癌移植瘤生長，并非通過NK 細胞發(fā)揮作用，miR-16/15a-/-抑制MC38結腸癌移植瘤生長的機制仍需要進一步研究。