陶星宇,劉若南,焦玉茹,袁凱莉,潘琦,張紹鈴,陶書田

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)梨工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210095)

苯丙氨酸不僅是蛋白的組成部分也是苯丙素代謝途徑的主要前體[1]。在苯丙素代謝途徑中,苯丙氨酸經(jīng)過一系列酶的反應(yīng)合成木質(zhì)素單體,這些單體被運輸?shù)洁徑募?xì)胞壁聚合形成木質(zhì)素[2]。木質(zhì)素的積累是形成次生細(xì)胞壁的必要條件,其對于植物的形態(tài)支撐和水分運輸至關(guān)重要[3],也是植物從水生到陸生的重要標(biāo)志[4]。

前酪氨酸脫水酶(ADT)作為合成苯丙氨酸的關(guān)鍵酶,是碳底物進(jìn)入木質(zhì)素合成的關(guān)鍵樞紐[5]。光合作用在葉綠體中產(chǎn)生的含碳化合物通過多種代謝途徑進(jìn)入木質(zhì)素合成,其過程開始于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤蘚糖-4-磷酸(E4P)在莽草酸途徑中轉(zhuǎn)化為分支酸鹽,這是芳香族氨基酸和其他化合物合成的直接前體,如維生素K1和B9[6]。在色氨酸生物合成途徑的初始反應(yīng)中,分支酸變位酶用于合成預(yù)苯酸和酪氨酸[7-8]。預(yù)苯酸氨基轉(zhuǎn)移酶將預(yù)苯酸轉(zhuǎn)化為前酪氨酸,最后通過ADT脫羧和脫水生成苯丙氨酸[9]。苯丙氨酸在經(jīng)過苯丙素代謝途徑合成木質(zhì)素單體后,再進(jìn)一步聚合成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的木質(zhì)素[10]。

‘碭山酥梨’是我國栽培面積最大,也是栽培歷史最悠久的梨品種之一。其果肉中含有大量石細(xì)胞,導(dǎo)致其口感和品質(zhì)不佳[11-12]。梨石細(xì)胞的形成是由木質(zhì)素大量積累所導(dǎo)致的[13],對于合成木質(zhì)素單體的苯丙素代謝途徑,相關(guān)的研究已經(jīng)較為完整[14-15],但是對于合成苯丙氨酸的上游基因ADT的研究較少,在梨中暫無相關(guān)報道。隨著人們對木質(zhì)素合成過程的進(jìn)一步研究,ADT的相關(guān)研究也有所進(jìn)展。近期,El-Azaz等[5]的研究發(fā)現(xiàn),海岸松(Pinuspinaster)中的轉(zhuǎn)錄因子PpMYB8能夠結(jié)合ADT基因的啟動子區(qū)域并調(diào)控該基因的表達(dá),進(jìn)而影響苯丙烷代謝途徑,最終調(diào)控木質(zhì)素的合成;Pascual等[16]研究表明,PpNAC1能夠激活PpMYB4的啟動子,PpMYB4通過激活PpMYB8對木質(zhì)素合成產(chǎn)生影響。這些結(jié)論都說明ADT是關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,是苯丙氨酸與木質(zhì)素合成調(diào)控過程中的重要樞紐。

本研究采用生物信息學(xué)手段,鑒定植物進(jìn)化過程中20個代表物種的ADT家族成員,分析其系統(tǒng)進(jìn)化和保守區(qū)域,并進(jìn)一步研究了梨ADT成員的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、共線性關(guān)系以及其在果實發(fā)育過程中的表達(dá)模式,通過對梨幼果進(jìn)行PbADT1的瞬時過量表達(dá),驗證ADT對梨果實石細(xì)胞的形成存在調(diào)控功能,為進(jìn)一步改良梨果實品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫搜索以及ADT家族成員鑒定

在PFAM網(wǎng)站(https://www.pfam.org)下載ADT家族成員的PF00800結(jié)構(gòu)域模型文件[17],在薔薇科基因組數(shù)據(jù)資源庫GDR(https://www.rosaceae.org)和Phytozome基因組數(shù)據(jù)資源庫(https://genome.jgi.doe.gov/portal)下載多個物種的CDS核苷酸序列文件、轉(zhuǎn)錄本氨基酸序列文件和基因注釋文件,使用HMMER v.3.2對含有PF00800結(jié)構(gòu)域的基因進(jìn)行鑒定(E-value=e-10),得到第一批候選基因。通過對擬南芥數(shù)據(jù)庫的查詢,得到AtADT基因,使用各物種氨基酸序列文件創(chuàng)建本地BLAST庫,以AtADT的氨基酸序列作為查詢序列,使用BLASTp v.2.8在本地庫中進(jìn)行比對(E-value=e-10),得到另一批候選基因。

兩批候選基因求并集,使用HMMSCAN對結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定(E-value=e-10),人工除去低相似度的序列和重復(fù)序列,在網(wǎng)站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)和PFAM(https://www.pfam.org)上鑒定家族成員的氨基酸序列是否存在PF00800結(jié)構(gòu)域和ACT結(jié)構(gòu)域。

1.2 ADT家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

通過Python腳本對中國白梨、擬南芥和水稻等20個物種的ADT家族成員進(jìn)行氨基酸序列提取,利用MAFFT v.7.4軟件對家族成員蛋白序列進(jìn)行比對,使用進(jìn)化分析軟件IQ-TREE v.1.6(bootstrap=1 000)對結(jié)果進(jìn)行處理,按照最大似然法(maximum likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 ADT家族成員保守基序分析

整理ADT家族成員的氨基酸序列文件,利用保守基序分析軟件MEME v.5.0分析ADT家族成員的保守基序,設(shè)定 motif值為 10,最小和最大判定長度分別設(shè)置為6和50。

1.4 ADT家族成員理化性質(zhì)分析

在ExPASy網(wǎng)站(https://www.expasy.org/)獲得ADT家族成員的蛋白質(zhì)理化性質(zhì);通過SignaIP網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測蛋白信號肽;使用在線軟件CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)對蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測;利用在線軟件TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。

1.5 ADT家族成員基因結(jié)構(gòu)和功能域分析

從基因注釋文件中提取ADT家族成員基因染色體位置信息,并整理基因位置結(jié)構(gòu)信息。通過在線軟件GSDS v.2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)分析各個成員編碼區(qū)、非編碼區(qū)以及內(nèi)含子結(jié)構(gòu)模式。使用Jalview v.2.10軟件對擬南芥、蘋果、梨、桃和高梁中的ADT氨基酸序列進(jìn)行比對并劃分結(jié)構(gòu)域。

1.6 ADT基因家族的共線性分析

使用MCscanX軟件對多個基因組和梨基因組之間進(jìn)行共線性分析,鑒別梨與梨、梨與擬南芥、梨與蘋果、梨與桃、梨與水稻和梨與高梁之間的同源性區(qū)域,之后通過Python包JCVI(https://github.com/tanghaibao/jcvi)進(jìn)行共線性關(guān)系的可視化。

1.7 梨ADT基因在果實發(fā)育過程中的表達(dá)分析

通過分析梨果實發(fā)育過程的RNA-seq數(shù)據(jù)[18],得到梨ADT基因的表達(dá)矩陣。使用R語言Pheatmap包對梨ADT家族繪制表達(dá)熱圖,對表達(dá)量(RPKM)使用lg(RPKM+1)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,按行對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。采用實時熒光定量PCR 驗證PbADTs在碭山酥梨果實發(fā)育過程中的表達(dá)情況,利用Primer v.5.0軟件設(shè)計引物,使用BLASTn v.2.8短序列比對功能確保引物在梨基因組中的特異性。利用 RNA Prep Pure Plant Kit(Tiangen)提取果肉RNA,用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,并用SYBR?PremixExTaqTMⅡ(TaKaRa)進(jìn)行實時熒光定量PCR。

1.8 瞬時轉(zhuǎn)化梨果實驗證PbADT1基因功能

利用Primer v.5.0設(shè)計PbADT1擴(kuò)增引物,以反轉(zhuǎn)錄的‘碭山酥梨’cDNA為模板,對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。制作10 g·L-1的瓊脂凝膠,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,并回收目的基因。采用Xue等[19]的方法,將PbADT1的CDS序列插入GFP的上游,形成35S-PbADT1-GFP融合表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌誘導(dǎo),用帶有針頭的注射器將菌液緩慢勻速注射到盛花后35 d左右的梨幼果中。設(shè)置2種注射方案:1)選取1個果實兩側(cè)進(jìn)行35S-PbADT1-GFP菌液注射,以另1個生長狀態(tài)相近的果實作為對照,注射GFP空載菌液;2)對同一個果實一側(cè)注射35S-PbADT1-GFP菌液,另一側(cè)注射GFP空載菌液作為對照。注射過的幼果于22 ℃培養(yǎng)室中避光24 h,之后放在22 ℃、光照/黑暗時間為16 h/8 h的條件下培養(yǎng)7～8 d,取果實截面,間苯三酚染色以觀察石細(xì)胞分布。使用溴乙酰法測定果肉中木質(zhì)素含量[13],采用熒光定量PCR測定苯丙素通路關(guān)鍵基因的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ADT家族成員鑒定

由表1可見:在20個物種中共鑒定出ADT家族成員113個,其中包含9個擬南芥成員、8個梨成員、7個蘋果成員、3個桃成員和4個高梁成員。根據(jù)各物種染色體上的先后順序?qū)易宄蓡T依次命名(表2),其中梨ADT家族成員分別分布在Chr3、Chr5、Chr6、Chr10和Chr11上,氨基酸序列大小為358～431,相對分子質(zhì)量為(39.26～47.02)×103,等電點(pI)為 6.11～6.54,不穩(wěn)定系數(shù)為30.70～47.72。利用在線軟件CELLO v.2.5進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測,結(jié)果表明所有成員均定位在細(xì)胞質(zhì)中。通過TMHMM Server v.2.0網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該家族成員都不具有跨膜結(jié)構(gòu)。通過在線軟件SignaIP預(yù)測,該家族中沒有含信號肽的成員。

表1 各物種ADT家族成員統(tǒng)計Table 1 Statistics of ADT family members in multiple species

表2 被子植物ADT家族成員信息Table 2 Angiosperm ADT family member information

2.2 ADT家族的進(jìn)化和分類

如圖1所示,將ADT家族按照系統(tǒng)發(fā)育樹分為4個亞組:Ⅰ亞組共6個成員,主要由藻類植物的成員組成;Ⅱ亞組共13個成員,主要由裸子植物的成員組成;Ⅲ亞組共60個成員,主要由藻類、石松類、蕨類植物和部分被子植物的成員組成;Ⅳ亞組共34個成員,主要由擬南芥、水稻等被子植物和部分裸子植物的成員組成。

圖1 基于ADT家族蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the protein sequence of the ADT family of multiple species 左上角為bootstrap計算后的可信度色條,從上到下依次升高,在進(jìn)化樹的各分叉處均標(biāo)注1個可信度的數(shù)值,其顏色和左上角色條對應(yīng)。綠、黃、紫、藍(lán)4種顏色的進(jìn)化支表示ADT家族成員的分類。The upper left corner is the credibility color bar calculated by bootstrap,which rises from top to bottom. Each bifurcate of the evolutionary tree is marked with a credibility value,and its color corresponds to the upper left role bar. The evolutionary branches of the four colors of green,yellow,purple and blue represent the classification of members of the ADT family.

2.3 ADT家族保守基序分析

將梨ADT家族蛋白中的10個保守基序分別命名為motif 1—motif 10。如圖2所示:各物種內(nèi)保守基序的構(gòu)成較為相似。motif 1、motif 2、motif 3、motif 4、motif 5、motif 7、motif 9是水生藻類ADT家族典型的保守基序,在后續(xù)的陸生植物中逐漸演化出了更多motif種類。

圖2 植物史中ADT家族蛋白保守基序組成Fig.2 The conserved motif composition of ADT family proteins in plant history

2.4 ADT家族的基因結(jié)構(gòu)和蛋白區(qū)域分析

如圖3-A所示:被子植物ADT基因有2種典型基因結(jié)構(gòu),其中一種是內(nèi)含子缺失,只含 1個外顯子的典型結(jié)構(gòu)模式,如薔薇科中的PbADT1、PbADT7、MdADT2和PpADT2;另一種是多內(nèi)含子的基因結(jié)構(gòu)。圖3-B 比對了部分薔薇科、擬南芥和高梁的ADT基因氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)所有成員均含有2個特征區(qū)域:位于序列110位左右的PDT結(jié)構(gòu)域和位于序列末端的ACT區(qū)域。

圖3 被子植物ADT基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守功能域Fig.3 Exon/intron structure of the ADT genes and protein conserved domains in angiosperm A.梨、蘋果、桃、擬南芥和高梁ADT的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)示意圖;B. ADT基因編碼蛋白保守功能域。*表示薔薇科物種中的氨基酸突變點。A. The schematic diagram of the exon/intron structure of ADT in pear,apple,peach,Arabidopsis and sorghum;B. ADT gene encoded protein conserved domain. * indicates amino acid mutation points in Rosaceae species.

2.5 梨ADT家族基因成員的染色體定位和共線性分析

由圖4可見:通過對梨種內(nèi)、梨與薔薇科和梨與大田作物的多基因組比對,鑒定出多處含有ADT基因的同源關(guān)聯(lián)區(qū)塊,梨ADT位于Chr3和Chr11的同源區(qū)塊在物種間呈現(xiàn)高度保守性。梨與薔薇科物種的關(guān)聯(lián)區(qū)塊密集,共線性高,梨與擬南芥和大田作物的共線性低,印證了薔薇科內(nèi)較近的親緣關(guān)系。

圖4 梨與多物種之間的共線性Fig.4 Collinearity between pear and other species A.梨物種內(nèi)、梨與擬南芥之間的共線性;B.梨與薔薇科物種之間的共線性;C.梨與大田作物之間的共線性。每個獨立的條形代表染色體,條形上方數(shù)字表示染色體編號,物種間灰色的連接線段表示同源區(qū)塊間的關(guān)聯(lián),著色連接線表示該關(guān)聯(lián)的同源區(qū)域包含ADT基因。A. Collinearity between pear species and between pear and Arabidopsis;B. Collinearity between pear and Rosaceae;C. Collinearity between pear and field crops. Each individual bar represents a chromosome,the number above the bar represents a chromosome number,the gray connective segments between species represent associations between homologous regions,and the colored connector lines indicate that the homologous regions of association contain ADT genes.

2.6 梨ADT基因在果實發(fā)育過程中的表達(dá)情況

由圖5可見:梨果實發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明,PbADT5在果實發(fā)育中不表達(dá),ADT基因的高水平表達(dá)集中在盛花期后35 d。對梨幼果的6個發(fā)育時期進(jìn)行熒光定量PCR,結(jié)果(圖6)顯示,PbADT1、PbADT3、PbADT6和PbADT7的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組一致,呈先上升后下降的趨勢,并集中在花后35和45 d高水平表達(dá)。梨果實中石細(xì)胞團(tuán)在這個時期大量形成,ADT可能通過合成苯丙氨酸為苯丙素途徑提供底物,使木質(zhì)素積累從而形成石細(xì)胞。

圖5 梨ADT基因在果實發(fā)育過程中的表達(dá)熱圖Fig.5 Heatmap of expression of ADT gene in pear during fruit development and pollen tube growth單元格的紫色表示lg(RPKM+1)均一化后的數(shù)值,顏色越深代表基因表達(dá)水平越高。The purple color of the cell represents the normalized value of lg(RPKM+1),and the deeper color shows higher gene expression level.

圖6 梨ADT基因的表達(dá)量Fig.6 Expression level of ADT genes in pear fruit

2.7 PbADT1過表達(dá)對梨幼果木質(zhì)素合成及苯丙素通路的影響

如圖7所示:過表達(dá)PbADT1的果實中木質(zhì)素含量比對照顯著增加27.9%,通過染色后的橫截面可以看出石細(xì)胞的分布更為密集。同樣,在果實個體內(nèi),過表達(dá)PbADT1的區(qū)域木質(zhì)素含量比對照區(qū)域顯著增加40.3%。苯丙素代謝通路和木質(zhì)素單體聚合中的部分關(guān)鍵酶在PbADT1過表達(dá)后的果肉中表達(dá)水平顯著提高。

圖7 PbADT1在梨果實中的過表達(dá)Fig.7 Overexpression of PbADT1 in pear fruit A.梨幼果在不同梨果實中石細(xì)胞的分布圖;B.梨幼果在同一果實中石細(xì)胞的分布圖;C. PbADT1超表達(dá)后的木質(zhì)素含量差異;D. PbADT1超表達(dá)后的木質(zhì)素合成酶基因表達(dá)差異。**P<0.01。A. The stone cell distribution map of young pear fruit between individuals;B. The stone cell distribution map of young pear fruit within individuals;C. The difference in lignin content after the overexpression of PbADT1;D. The difference in lignin synthase expression after the overexpression of PbADT1. **P<0.01.PAL:苯丙氨酸解氨酶Phenylalanine ammoniay lyase;CAD:肉桂醇脫氫酶Cinnamyl alcohol dehydrogenase;HCT:莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶Hydroxycinnamoyl-coenzyme A shikimate/quinate hydroxycinnamoyl;POD:過氧化物酶Peroxidase.

3 討論

前酪氨酸脫水酶作為苯丙氨酸合成和木質(zhì)素合成之間的關(guān)鍵樞紐,其水解產(chǎn)物苯丙氨酸是木質(zhì)素單體的合成底物,其在植物生長發(fā)育和次生代謝中有不可替代的重要性[5,8,20],在20個物種中均有ADT基因被鑒定,印證了這一古老基因由來已久。木質(zhì)素是一種復(fù)雜的疏水聚合物[21-22],為植物提供結(jié)構(gòu)剛度和防水性,是植物實現(xiàn)形態(tài)支撐和長距離水分運輸?shù)年P(guān)鍵物質(zhì),因此木質(zhì)素的出現(xiàn)被認(rèn)為是植物從水生到陸生的關(guān)鍵進(jìn)化,也是植物形成維管系統(tǒng)的基礎(chǔ)[23-24]。然而,木質(zhì)素的出現(xiàn)可能比維管植物的起源更加古老,其前體對香豆酸以及木質(zhì)素合成途徑的關(guān)鍵基因被發(fā)現(xiàn)存在于定鞭藻類[25]。此外,在硅藻和綠藻中發(fā)現(xiàn)了香豆酸及其衍生的類黃酮化合物[26]。這些浮游植物合成單木質(zhì)素醇的潛力表明,木質(zhì)素合成的部分途徑可能已在古代海洋中進(jìn)化,并且早于陸地植物的起源。鑒于合成木質(zhì)素單體的苯丙素生物代謝途徑在藻類中已有雛形,并在陸生植物中不斷完善[27-29],推斷合成苯丙素的ADT基因也在藻類進(jìn)化后發(fā)生擴(kuò)張,本研究的鑒定結(jié)果與之相一致。在鑒定出的113個ADT成員中,紅藻門和綠藻門的6個水生物種均含有1個ADT基因,在后續(xù)的植物進(jìn)化過程中,ADT基因家族在各物種中得到了不同程度的擴(kuò)張,同時ADT氨基酸序列的相似度在植物的進(jìn)化過程中不斷向高等植物靠攏,7個motif在藻類后續(xù)的物種進(jìn)化中具有高度的保守性。

雖然木質(zhì)素對植物的生理功能有不可替代的重要作用,但在梨果實中,木質(zhì)素的積累也導(dǎo)致了石細(xì)胞的形成[13]。‘碭山酥梨’中較高的石細(xì)胞含量導(dǎo)致其果實口感不佳,因此減少石細(xì)胞含量對梨果實的經(jīng)濟(jì)價值具有重要意義,對木質(zhì)素合成基因的探究也可以為改善果肉口感奠定理論基礎(chǔ)[30]。本研究通過對ADT基因家族的生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)梨ADT家族共包含8個基因,分布在梨的5條染色體上。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示,所有家族成員的蛋白均定位在細(xì)胞質(zhì)中且無跨膜結(jié)構(gòu),這符合前酪氨酸脫水酶在莽草酸途徑中對苯丙氨酸前體進(jìn)行脫水的功能。梨的絕大部分ADT家族成員均有多個內(nèi)含子,個別成員內(nèi)含子缺失,說明此家族可能存在選擇性剪切,在擬南芥中確實存在1個ADT基因編譯多個轉(zhuǎn)錄本的現(xiàn)象,如AT1G11790.1和AT1G11790.2。

石細(xì)胞在梨果實的發(fā)育過程中,一般發(fā)育早期含量較高,花后1個月達(dá)到最高峰,此后隨著果實發(fā)育膨大石細(xì)胞占比減少,到果實成熟前2個月數(shù)量趨于穩(wěn)定?！喞妗贩N的石細(xì)胞團(tuán)在花后30 d開始大量形成,花后60 d達(dá)到峰值,而‘碭山酥梨’石細(xì)胞在開花后20 d左右開始分化,花后40～50 d出現(xiàn)大量石細(xì)胞團(tuán)[20]。本研究表明,在果實發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組中多數(shù)ADT基因在‘碭山酥梨’花后40 d呈現(xiàn)最高表達(dá)水平,這表明ADT基因的表達(dá)水平對于梨石細(xì)胞的形成具有一定的正向調(diào)控作用。不僅如此,ADT基因的高水平表達(dá)會為苯丙素代謝途徑提供大量底物,其指向木質(zhì)素、木脂素和黃酮類化合物等苯丙素衍生物的合成[31-32],果實的抗氧化能力和黃酮含量密切相關(guān)[33],這進(jìn)一步闡釋了梨果實在幼果期具有較好的抗氧化能力。PbADT1的過表達(dá)可以使梨幼果中木質(zhì)素含量以及其關(guān)鍵合成酶的表達(dá)水平得到顯著提升,并增強(qiáng)了石細(xì)胞團(tuán)的形成與擴(kuò)散,表明PbADT1作為苯丙素合成的上游酶,對梨的次生代謝起到至關(guān)重要的作用。