毛文點　庹玲玲　齊文續(xù)　蘇睿智　鄧常清　鄒龍

〔摘要〕 目的 觀察黃芪-當歸不同配比對毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、阿魏酸及洋川芎內(nèi)酯I含量的影響。方法 采用水提法制備黃芪、當歸及黃芪-當歸不同配比（5∶1、1∶1、1∶5）的藥液，通過高效液相色譜法對6種主要成分分別進行線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性及回收率檢測。結(jié)果 6種對照樣品線性關(guān)系良好，儀器的精密度、樣品的重復(fù)性及回收率均滿足標準。黃芪-當歸5∶1配伍時，6種成分的溶出量均未達90%;當配伍為1∶1和1∶5時，6種成分的溶出大多高于或接近100%。結(jié)論 黃芪-當歸以1∶1和1∶5配伍時可促進兩者主要成分的溶出，且1∶1配伍時溶出效果最好，說明在1∶1配伍時當歸對有效成分的溶出有促進作用。

〔關(guān)鍵詞〕 高效液相色譜法;黃芪;當歸;黃酮類成分;阿魏酸;洋川芎內(nèi)酯I;含量測定

〔中圖分類號〕R284.2? ? ? ? 〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.03.005

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of different ratios of Huangqi （Astragali Radix）-Danggui （Angelicae Sinensis Radix） on the contents of calycosin-7-O-glucoside， calycosin， ononin， formononetin， ferulic acid and senkyunolide I. Methods The medicinal solutions of Huangqi （Astragali Radix）， Danggui （Angelicae Sinensis Radix） and Huangqi （Astragali Radix）-Danggui （Angelicae Sinensis Radix） in different ratios （5∶1， 1∶1， 1∶5） were prepared by water extraction method， and the linear relationship， precision， repeatability and recovery rate of the 6 main components were tested by high performance liquid chromatography. Results The linear relationship of the 6 control samples was good， and the precision of the instrument， the repeatability of the sample and the recovery rate all met the standards. When the Huangqi （Astragali Radix）-Danggui （Angelicae Sinensis Radix） 5∶1 compatibility， the dissolution of the 6 components was lower than the 90%; when the compatibility was 1∶1 and 1∶5， the dissolution of the 6 components was mostly higher than or close to 100%. Conclusion Huangqi （Astragali Radix）-Danggui （Angelicae Sinensis Radix） can promote the dissolution of most ingredients in the medicine when the compatibility is 1∶1 and 1∶5， and the dissolution effect is the best when the compatibility is 1∶1， indicating that Danggui （Angelicae Sinensis Radix） can promote the dissolution of active ingredients in the 1∶1 compatibility.

〔Keywords〕 high performance liquid chromatography; Huangqi （Astragali Radix）; Danggui （Angelicae Sinensis Radix）; flavonoids; ferulic acid; senkyunolide I; assay

藥對是中醫(yī)學(xué)精粹之一，是中醫(yī)臨床遣藥組方常用的配伍形式，許多藥對已成為經(jīng)典名方。黃芪-當歸配伍是常用的補氣生血類藥對，通常用于治療血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)及其腫瘤等疾病，在臨床上應(yīng)用頻繁[1-4]。在中藥復(fù)方中，名同實異的當歸補血湯有很多，其中，使用最多的源自李東垣所創(chuàng)《內(nèi)外傷辨惑論》，該方由黃芪5倍于當歸配伍組成[5]。

已有研究表明，黃芪中的主要活性成分為黃酮、皂苷以及多糖[6]。當歸中的主要成分為當歸多糖、有機酸和揮發(fā)油等[7]，在兩者配伍中，黃芪中的黃芪甲苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素和當歸中的阿魏酸均有較高含量[8]。黃芪當歸不同配比，主要成分含量會發(fā)生不同改變。研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮為典型的植物雌激素，產(chǎn)生雌激素樣作用，還有抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用[9];毛蕊異黃酮苷具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[10];芒柄花素具有抗氧化、抗病毒等作用[11];阿魏酸是當歸中的主要成分之一，具有抗氧化、抗血栓、降血脂等作用[12];洋川芎內(nèi)酯I具有抗氧化損傷、抗炎鎮(zhèn)痛以及抗凝及抗血小板聚集等作用[13]。中藥中的有效成分眾多，不同成分之間的藥理作用有一定差異，兩藥合用會對藥理作用及各成分的含量等方面產(chǎn)生一定影響。本文通過研究黃芪-當歸不同比例配伍下6種主要藥效成分的含量變化，以探求其配伍規(guī)律，為接下來研究各成分在動物體內(nèi)外的吸收情況提供研究基礎(chǔ)，同時也為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1? 實驗儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）;AR224CN電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市中天儀器科技有限公司）;H3-20KR臺式高速冷凍離心沉淀機（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）;Eppendorf微量移液器（德國艾本德股份公司）;超聲清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2? 實驗用藥

黃芪、當歸均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供并鑒定，當歸樣品為傘形科植物當歸Angelica sinensis （Oliv.） Diels的干燥根，黃芪為豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge.的干燥根。毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、阿魏酸及洋川芎內(nèi)酯I均購自上海源葉生物科技有限公司，批號分別為R31A10F96530、Y11J10H92789、

P03A10F84910、F27J7S18516、H27J7L16718、P16A10

F85918，純度均≥98%。乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3? 色譜條件

Welchrom HPLC C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～16 min 20% B，16～25 min 20%～32% B，25～34 min 32%～34% B，34～45 min 34%～48% B，45～65 min 48%～65% B），柱溫35 ℃，流速1 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長280 nm。

1.4? 對照品溶液的制備

應(yīng)用電子分析天平精密稱取適量對照品毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素，分別置于10 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成濃度分別為600、620、520、540、580、630 μg/mL的對照品儲備溶液。

1.5? 黃芪當歸不同配伍水提液的制備

設(shè)立以下5個組，單用當歸組、單用黃芪組、黃芪-當歸5∶1、1∶1、1∶5組。按照以上比例分別稱取適量藥材飲片，以水熱回流法提取3次，第1次8倍量的水提取1 h，第2、3次6倍量的水提取1 h，合并3次提取液，真空減壓濃縮至生藥量1.0 g/mL備用[14]。

1.6? 供試品溶液的制備

精密量取各不同比例配伍的藥液1 mL，置于10 mL離心管中，加甲醇8 mL，混合，3 000 r/min離心12 min，離心半徑為9 cm，吸取上清液，甲醇溶液定容至10 mL，搖勻，經(jīng)0.22 μL微孔濾膜濾過，即得。

2 結(jié)果

2.1? 方法學(xué)考察

2.1.1? 線性關(guān)系考察? 精密吸取對照品儲備溶液，分別加甲醇定容至5 mL的容量瓶中，得到毛蕊異黃酮苷的濃度為1.875、3.75、7.5、15、30、60、120 μg/mL，阿魏酸的濃度為3.875、7.75、15.5、31、62、124 μg/mL，洋川芎內(nèi)酯I的濃度為1.625、3.25、6.5、13、26、52 μg/mL，芒柄花苷的濃度為3.125、6.25、13.5、21.6、27、54 μg/mL，毛蕊異黃酮的濃度為1.719、3.438、6.875、13.75、27.5、55 μg/mL，芒柄花素的濃度為1.575、3.15、6.3、12.6、25.2、50.4 μg/mL。按照“1.3”項下的色譜條件進行測定，并記錄其峰面積，以各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸分析，繪制標準曲線，求得6種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)R以及線性范圍。見表1。

2.1.2? 精密度實驗 取黃芪-當歸1∶1組的供試品溶液，連續(xù)進樣6次，每次進樣10 μL，測得毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積的相對標準偏差RSD值分別為0.20%、0.14%、0.07%、0.19%、0.15%、1.08%，表明儀器精密度好。

2.1.3? 穩(wěn)定性實驗? 取黃芪-當歸1∶1配伍組的供試品溶液，在配制后的0、2、4、6、8、12 h進樣分析，每次進樣10 μL，測得毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積的相對標準偏差RSD值分別為0.57%、3.43%、0.12%、0.31%、0.43%、1.34%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4? 重復(fù)性實驗? 精密量取黃芪-當歸1∶1配伍組的原藥液6份，每份1 mL，配制供試品溶液，各進樣10 μL，測得毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積的相對標準偏差RSD值分別為1.76%、2.47%、1.56%、1.54%、1.46%、1.16%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5? 加樣回收率實驗? 精密量取已知6種化合物含量的黃芪-當歸1∶1配伍組的原藥液6份，每份1 mL，制備供試品溶液，每份中精密加入毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰標準品19.9、7.6、3.7、6.0、1.75、1.7 μg。色譜條件下進樣分析，計算各對照品的加樣回收率。見表2。

2.2? 供試品含量測定

精密量取各配伍組藥液1 mL，制備成供試品溶液，各配伍組均平行配制3份，在“1.3項”色譜條件下進樣分析，測定不同配伍劑量藥液中6種主要成分的實際含量及溶出率。溶出率（%）=不同配比提取液的實測含量/該配比下的理論含量×100%，理論含量指單味藥材在此配伍下應(yīng)測得的含量值。結(jié)果顯示，黃芪-當歸為傳統(tǒng)5∶1配伍時，6種成分的溶出率均低于90%;1∶5配伍時，芒柄花素的溶出顯著增加，毛蕊異黃酮則明顯降低，其余成分與理論值接近;1∶1配伍時，除阿魏酸溶出率明顯降低外，其他5種成分的溶出率均高于或接近100%。實驗結(jié)果表明，在傳統(tǒng)黃芪-當歸5∶1配伍下毛蕊異黃酮苷及芒柄花苷的總含量高于1∶1組，其余各成分含量顯著低于或接近1∶1組分，黃芪-當歸以1∶1和1∶5配伍時可促進藥液中大多數(shù)成分的溶出，尤其在1∶1配伍時，當歸對黃芪中有效成分的溶出有顯著的促進作用。見表3。

3 討論

3.1? 色譜條件的考察

本試驗分別考察了甲醇-0.3%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.3%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水對于黃芪與當歸中 6種成分的洗脫能力，結(jié)果表明，當流動相為乙腈-0.1%磷酸水時，在梯度洗脫的條件下，對于目標成分的分離效果均較好。同時，在乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫的條件下，也考察了在20、25、30、35 ℃不同溫度下的影響，結(jié)果表明，隨著溫度的升高，分離度也逐步增加，35 ℃時分離效果最佳。

3.2? 指標成分的選擇

以當歸補血湯中的藥物“黃芪”“當歸”為關(guān)鍵詞，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫查詢當歸補血湯中的成分，分析得當歸補血湯中共有27個活性成分，其中23個屬于黃芪，4個屬于當歸[15]，此藥對中黃芪活性成分遠多于當歸，且劉傲雪[16]研究當歸補血湯在體代謝過程中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ為7種原型成分。本實驗通過指紋圖譜發(fā)現(xiàn)除黃芪甲苷外的其余6種成分響應(yīng)值較高，因此，選擇這幾種作為指標成分來檢測不同配比的溶出效果，為后續(xù)的大鼠吸收實驗奠定基礎(chǔ)。

3.3? 不同配伍比例的設(shè)立

本課題組前期研究表明，黃芪和當歸配伍在減輕血管局部炎性反應(yīng)中，單用當歸及黃芪-當歸1∶1配伍時作用較強[17]，在促進造血的功效中，黃芪與當歸以1∶1、1∶2.5、1∶5比例配伍時的促造血作用較佳[18]。本實驗以黃芪-當歸1∶1配伍為基礎(chǔ)，設(shè)立不同的配伍比例，以比較主要成分的溶出效果，與后期藥理實驗相結(jié)合，可望找出有效配伍比例。

3.4? 配伍前后主要化學(xué)成分變化及其意義

當歸補血湯中黃芪與當歸的配伍比例不同時，主要成分含量及藥理作用均會發(fā)生較大變化[19]，顧志榮等[20]研究中黃芪-當歸傳統(tǒng)5∶1配伍時，毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯5種指標性成分含量降低顯著。唐蓉等[21]對黃芪-當歸配伍比例10∶1、5∶1、1∶1、1∶5中的主要化學(xué)成分進行測定，結(jié)果顯示，黃芪-當歸按10∶1和5∶1配伍時，其主要化學(xué)成分的含量與理論值相近或較低。而黃芪-當歸1∶1和1∶5配伍時，可促進藥物中部分成分的溶出。本研究對唐蓉研究進行優(yōu)化，刪減溶出率較低的10∶1配伍組，同時新增含量較高且具有增強免疫功能、抗缺血性損傷等作用的芒柄花苷及具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗凝和抗血小板聚集等作用的洋川芎內(nèi)酯I作為考察對象，為本課題組后期研究黃芪-當歸配伍改善病理性血管重構(gòu)提供理論依據(jù)。結(jié)論得出，黃芪-當歸5∶1配伍時，6種成分的實際含量均低于理論含量，而1∶1和1∶5配伍時，主要成分含量溶出增加，且1∶1溶出效果最好。動物實驗發(fā)現(xiàn)，黃芪當歸以5∶1配伍時促血管新生療效最好[22]。黃小平等[18]用當歸黃芪單體及不同比例配伍對抑制骨髓造血功能模型小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，各配比均可不同程度地提高骨髓造血功能，其中當歸黃芪按1∶1、1∶2.5、1∶5配比時效果最好。當歸補血湯中黃芪-當歸不同配比其作用效果并不固定，應(yīng)根據(jù)不同需要靈活應(yīng)用。綜上所述，本研究通過對黃芪-當歸在不同配伍時其主要成分的溶出率的考察，可為后期研究黃芪當歸配伍改善病理性血管重構(gòu)的藥效物質(zhì)提供實驗依據(jù)。

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