王 臻，秦文娟，翟子敬,馮 佳，黃 磊，董珊珊，蘆桂林*

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，新疆 石河子 832008；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，新疆 石河子 832008)

膿毒癥是嚴(yán)重威脅生命的全身性感染疾病，可合并器官功能障礙，約80%嚴(yán)重膿毒癥患者存在心肌抑制，且40%心肌抑制可發(fā)展為心肌損傷[1]。紅景天苷萃取于植物紅景天，具有抗炎、抗腫瘤和神經(jīng)保護功能等多種作用[2]，可改善冠狀動脈血流，保護心肌，抑制心室重構(gòu)，抗心律失常及減輕再灌注損傷等[3]。左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction， LVEF)為評價心功能的主要指標(biāo)，但無法全面反映心肌分層及節(jié)段相關(guān)運動情況。建立在二維斑點追蹤成像(two-dimensional speckle tracking imaging， 2D-STI)基礎(chǔ)上的分層應(yīng)變技術(shù)可獲得左心室三層心肌及各節(jié)段心肌峰值應(yīng)變，精確評估各層心肌功能[4]。本研究采用2D-STI技術(shù)評價紅景天苷對膿毒癥大鼠心臟及心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 紅景天苷(北京索萊寶科技有限公司，純度99%)，脂多糖(Sigma)，心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ， cTnⅠ)試劑盒、腦鈉肽(brain natriuretic peptide， BNP)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗動物及分組 將32只12周齡無特定病原體(specific pathogen free， SPF)級SD雄性大鼠[石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動物實驗中心提供，許可證：SCXK(新)2011-0004]隨機均分為對照組、膿毒癥組、低劑量組及高劑量組，分籠喂養(yǎng)，室溫18～26℃，相對濕度40%～70%，光照明暗周期12 h，自由采食與飲水。

1.3 模型制備 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，對照組、膿毒癥組以15 mg/kg體質(zhì)量生理鹽水灌胃7天，低、高劑量組紅景天苷(15 mg/kg、30 mg/kg體質(zhì)量)連續(xù)灌胃7天，均為每日1次。于末次灌胃后1 h予膿毒癥組、低、高劑量組10 mg/kg體質(zhì)量脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)，對照組以等體質(zhì)量生理鹽水腹腔注射[5]。觀察大鼠一般情況。

1.4 心臟超聲參數(shù)測量 于腹腔注射后12 h以10%水合氯醛(3.5 ml/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉大鼠，左側(cè)臥位保定于檢查臺，固定四肢及門齒，連接小動物心電圖。由1名具有5年以上工作經(jīng)驗的超聲科醫(yī)師采用GE Vivid E9彩色多普勒超聲診斷儀，12S心臟探頭，頻率12 MHz，于胸骨旁長軸切面測量左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter， LVEDD)、室間隔舒張末期厚度(interventricular septal thickness at end-diastole， IVSD)、左心室后壁舒張末期厚度(left ventricular posterior wall thickness at end diastole， LVPWD)、左心室短軸縮短率(left ventricular fraction shortening， LVFS)及LVEF。采集左心室短軸乳頭肌水平動態(tài)圖(>10個心動周期)并導(dǎo)入EchoPAC工作站，手動勾畫ROI，記錄左心室心內(nèi)膜下層心肌(global circumferential strain in subendocardial myocardium， GCS-Endo)、中層心肌(global circumferential strain in middle myocardium， GCS-Mid)及心外膜下層心肌(global circumferential strain in subepicardial myocardium， GCS-Epi)圓周應(yīng)變，分析各節(jié)段(前壁、側(cè)壁、后壁、下壁、前間隔及后間隔)圓周應(yīng)變率(circumferential strain rate， SrC)。以上參數(shù)均測量3次，以平均值的絕對值作為結(jié)果。

1.5 心肌指標(biāo) 于下腔靜脈采血3 ml，-80℃保存。按照cTnⅠ及BNP試劑盒相關(guān)說明進(jìn)行操作。所有檢測均重復(fù)3次，取平均值作為結(jié)果。

1.6 病理學(xué) 采血后處死大鼠，摘取心臟后沖洗、甲醛固定，常規(guī)行HE染色，封片后于光鏡下觀察心肌形態(tài)學(xué)變化。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。以±s表示服從正態(tài)分布的計量資料，采用單因素方差分析比較組間超聲參數(shù)及心肌指標(biāo)差異。以Spearman相關(guān)分析評價2D-STI參數(shù)與cTnⅠ、BNP的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對照組大鼠反應(yīng)靈敏，采食、飲水正常。膿毒癥組大鼠背毛豎起、皮溫降低、呼吸短促，活動減少，精神狀態(tài)差，對刺激反應(yīng)減弱，不采食，伴腹瀉等。低劑量組大鼠背毛蓬松，活動減少，采食量減少，刺激反應(yīng)稍弱，少量稀水樣便。高劑量組大鼠采食飲水，行動緩慢，反應(yīng)略遲緩，一般情況尚可。

2.2 超聲心動圖參數(shù) 膿毒癥組、低、高劑量組LVFS、LVEF均明顯低于對照組(P均<0.05)。低劑量組LVEF明顯高于膿毒癥組(P<0.05)；高劑量組LVFS、LVEF均明顯高于膿毒癥組及低劑量組(P均<0.05)；其余參數(shù)組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠常規(guī)超聲心動圖參數(shù)比較(±s，n=8)

表1 各組大鼠常規(guī)超聲心動圖參數(shù)比較(±s，n=8)

組別LVEDD(mm)IVSD(mm)LVPWD(mm)LVFS(%)LVEF(%)對照組4.82±0.201.57±0.111.79±0.1149.33±1.1183.78±1.52膿毒癥組4.81±0.161.57±0.101.79±0.1435.55±1.58?65.52±3.11?低劑量組4.85±0.161.59±0.081.77±0.1338.15±1.42?69.53±5.28?#高劑量組4.83±0.151.57±0.111.78±0.1442.40±3.67?#▲73.91±5.41?#▲F值0.090.070.0560.0628.48P值0.960.970.98<0.01<0.01

注：*：與對照組比較P<0.05；#：與膿毒癥組比較P<0.05；▲：與低劑量組比較P<0.05

2.3 2D-STI參數(shù) 各組GCS-Endo及GCS-Mid差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。膿毒癥組及低劑量組GCS-Endo、GCS-Mid均明顯低于對照組(P均<0.05)；低、高劑量組GCS-Endo、GCS-Mid均明顯高于膿毒癥組(P均<0.05)；高劑量組GCS-Endo、GCS-Mid均明顯高于低劑量組(P均<0.05)。僅對照組與膿毒癥組間GCS-Epi差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1及表2。

圖1 大鼠左心室各層心肌應(yīng)變圖 A.對照組； B.膿毒癥組； C.低劑量組； D.高劑量組

表2 各組大鼠左心室分層整體圓周應(yīng)變比較(±s，n=8)

表2 各組大鼠左心室分層整體圓周應(yīng)變比較(±s，n=8)

組別GCS-Endo(%)GCS-Mid(%)GCS-Epi(%)對照組24.13±2.2314.22±1.778.00±3.23膿毒癥組11.68±1.80?6.68±2.00?5.48±1.69?低劑量組19.27±1.92?#10.10±1.54?#6.48±1.25高劑量組23.01±1.61#▲12.86±1.20#▲6.92±2.15F值69.6832.171.77P值<0.01<0.010.17

注：*：與對照組比較P<0.05；#：與膿毒癥組比較P<0.05；▲：與低劑量組比較P<0.05

各組左心室各節(jié)段SrC差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。膿毒癥組左心室各節(jié)段SrC均低于對照組(P均<0.05)；低、高劑量組除前壁外各節(jié)段SrC均低于對照組(P均<0.05)；低劑量組前壁及后壁SrC高于膿毒癥組(P均<0.05)；高劑量組除前間隔外其余節(jié)段SrC均高于膿毒癥組(P均<0.05)；側(cè)壁、后壁、下壁及后間隔SrC均高于低劑量組(P均<0.05)，見表3及圖2。

圖2 大鼠左心室各節(jié)段心肌應(yīng)變圖 A.對照組； B.膿毒癥組； C.低劑量組； D.高劑量組

表3 各組大鼠左心室各節(jié)段SrC比較(±s，n=8)

表3 各組大鼠左心室各節(jié)段SrC比較(±s，n=8)

組別前壁(%)側(cè)壁(%)后壁(%)下壁(%)前間隔(%)后間隔(%)對照組4.80±1.245.15±0.976.76±0.868.52±0.876.99±1.557.31±0.53膿毒癥組2.92±0.71?3.19±0.61?2.72±0.39?2.24±0.59?3.13±1.19?4.26±0.65?低劑量組3.99±0.54#3.45±0.52?3.33±0.48?#2.85±0.77?4.20±0.83?3.84±0.81?高劑量組4.33±0.50#4.29±0.59?#▲5.95±0.31?#▲5.54±0.69?#▲4.21±1.03?5.42±0.87?#▲F值7.8412.8599.73119.2515.6135.81P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

注：*：與對照組比較P<0.05；#：與膿毒癥組比較P<0.05；▲：與低劑量組比較P<0.05

2.4 心肌指標(biāo) 對照組cTnⅠ、BNP均明顯低于其他3組(P均<0.05)；低、高劑量組cTnⅠ、BNP均明顯低于膿毒癥組(P均<0.05)；高劑量組cTnⅠ、BNP明顯低于低劑量組(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠心肌酶水平比較(±s，n=8)

表4 各組大鼠心肌酶水平比較(±s，n=8)

組別cTnⅠ(pg/ml)BNP(pg/ml)對照組320.75±33.16143.08±30.01膿毒癥組889.80±42.10?846.63±50.70?低劑量組756.15±36.87?#759.46±31.60?#高劑量組655.97±35.69?#▲709.43±28.11?#▲F值343.02620.63P值<0.01<0.01

注：*：與對照組比較P<0.05；#：與膿毒癥組比較P<0.05；▲：與低劑量組比較P<0.05

2.5 相關(guān)性分析 GCS-Endo、GCS-Mid、GCS-Epi與cTnⅠ均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.875、-0.862、-0.407，P均<0.05)；GCS-Endo、GCS-Mid、GCS-Epi與BNP均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.819、-0.845、-0.486，P均<0.05)。GCS-Endo與cTnⅠ間相關(guān)性最強。

2.6 病理學(xué) 光鏡下見對照組心肌細(xì)胞排列整齊，大小一致，核清晰可見，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常(圖3)；膿毒癥組心肌細(xì)胞排列紊亂，腫脹明顯，間質(zhì)充血水腫嚴(yán)重，血管充血擴張，心肌橫紋模糊，以心內(nèi)膜下心肌最為嚴(yán)重(圖4)；低劑量組心肌改變較膿毒癥組減輕，心肌細(xì)胞腫脹并排列欠規(guī)整，出現(xiàn)少量空泡樣改變，紅細(xì)胞滲出較多；高劑量組心肌細(xì)胞排列基本整齊，染色較均勻，細(xì)胞腫脹不明顯，紅細(xì)胞滲出較少，心肌橫紋尚清晰。

圖3 對照組大鼠心肌病理圖 A.心肌(HE，×4)； B～D.分別為心內(nèi)膜下、中層、心外膜下心肌(HE，×100)

圖4 膿毒癥組大鼠心肌病理圖 A.心肌(HE，×4)； B～D.分別為心內(nèi)膜下、中層、心外膜下心肌(HE，×100)

3 討論

發(fā)生膿毒癥時，革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的LPS可通過細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)炎癥因子級聯(lián)釋放，對線粒體功能造成影響，并激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，抑制心肌運動[6]。本研究建模后大鼠行動遲緩，對刺激反應(yīng)性減弱，采食、水次數(shù)減少，出現(xiàn)腹瀉，背毛豎起等表現(xiàn)，其LVFS、LVEF降低，血清cTnⅠ、BNP明顯上升；光鏡下見大量紅細(xì)胞滲出，心肌細(xì)胞腫脹且出現(xiàn)空泡樣改變，提示建模成功。

本研究膿毒癥組左心室各層心肌整體圓周應(yīng)變及各節(jié)段SrC均低于對照組；低、高劑量組各參數(shù)均不同程度升高，提示膿毒癥對心肌整體及各節(jié)段收縮期圓周運動均造成障礙，而紅景天苷對心肌具有保護作用，并能減輕損傷。多數(shù)健康人的圓周應(yīng)變以心內(nèi)膜中最高，其次為心肌和心外膜；收縮變形從心內(nèi)膜向心外膜存在梯度變化，有助于早期發(fā)現(xiàn)心肌變化[7]。心內(nèi)膜作為冠狀動脈終末血管的供血區(qū)域較早受膿毒癥影響。本研究膿毒癥組前間隔SrC與低、高劑量組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，可能原因在于膿毒癥對左心室前間隔心肌的損傷較為嚴(yán)重，無法緩解，且膿毒癥早期心內(nèi)膜下心肌細(xì)胞病理變化引起心肌纖維彈性下降，心肌運動出現(xiàn)異常[8]，即GCS-Endo及節(jié)段SrC下降；病理所見證實以心內(nèi)膜受累最為嚴(yán)重。

cTnⅠ、BNP可預(yù)測膿毒癥嚴(yán)重程度，并與早期心肌功能障礙和死亡率存在相關(guān)性[9]。本研究中GCS-Endo與cTnⅠ的相關(guān)性較高(r=-0.875，P<0.05)，提示2D-STI分層應(yīng)變分析可早期反映心臟功能變化[10]。

病理學(xué)觀察顯示低、高劑量組心肌細(xì)胞炎性浸潤及細(xì)胞腫脹均較膿毒癥組有所減輕，表明紅景天苷具有抗炎作用，與PU等[11]的結(jié)果相符。紅景天苷僅使少數(shù)患者心率加快[11]，或可長期使用。

綜上所述，2D-STI技術(shù)可用于評價紅景天苷對膿毒癥大鼠心肌的保護作用；GCS-Endo是較為敏感的監(jiān)測指標(biāo)。本研究的主要局限性：對嚙齒類動物盡管可獲取四腔心尖的視圖，但較少見左心室側(cè)壁，縱向圖像質(zhì)量較差，無法提供相關(guān)數(shù)據(jù)。