曹文怡，易少奎，楊楠，蘇君曉，羅雙雙，高澤霞，周小云

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖州 313000

作為脊椎動(dòng)物中分布最廣、種類最多的一個(gè)類群，魚類的性別決定機(jī)制有著原始性、多樣性以及可塑性等特點(diǎn)，同時(shí)存在雌雄異體、雌雄同體和單性群體等性別決定類型。但無(wú)論是哪種性別決定類型，其下游的性別決定因素卻都是相當(dāng)保守的，尤其是芳香化酶(aromatase)，可以催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，從而控制性腺發(fā)育甚至影響性別決定[1]。細(xì)胞色素P450芳香化酶(P450arom)是由cyp19a1基因編碼產(chǎn)生的。硬骨魚類中存在2種cyp19a1基因亞型：cyp19a1a和cyp19a1b。cyp19a1a主要在性腺中表達(dá)，因此其編碼產(chǎn)物稱為性腺型芳香化酶(P450aromA)；cyp19a1b則主要在腦中表達(dá)，其編碼產(chǎn)物稱為腦型芳香化酶(P450aromB)[2]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，cyp19a1a及其催化產(chǎn)生的雌激素不僅在卵巢分化與維持的過(guò)程中起到?jīng)Q定性的作用，而且在精巢的分化中也起到了關(guān)鍵性的作用，cyp19a1a上調(diào)對(duì)觸發(fā)和維持卵巢分化是必需的，而cyp19a1a的下調(diào)則是誘導(dǎo)精巢分化的一個(gè)必不可少的環(huán)節(jié)[3-4]。而cyp19a1b及其催化產(chǎn)生的雌激素與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期間的神經(jīng)內(nèi)分泌功能、性行為和性別分化密切相關(guān)[5]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，cyp19a1b還可能對(duì)魚類精巢的發(fā)育有重要的促進(jìn)作用[6]。

芳香化酶及其催化產(chǎn)生的雌激素，還可以通過(guò)GH-IGF通路調(diào)節(jié)魚類的生長(zhǎng)發(fā)育。比如，雌二醇可以調(diào)節(jié)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[7]、莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambcus)[8]、黃鱸(Diploprionbifasciatum)[9]中GH-IGF通路相關(guān)基因的表達(dá)水平，進(jìn)而影響生長(zhǎng)。

我國(guó)的野生泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)不僅有二倍體，在長(zhǎng)江流域還有大量的天然四倍體[10]。四倍體泥鰍的體型明顯大于二倍體，具有顯著的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)[11]。通過(guò)誘導(dǎo)雌核發(fā)育和雄核發(fā)育，研究人員發(fā)現(xiàn)，這些四倍體泥鰍是由二倍體泥鰍通過(guò)染色體加倍產(chǎn)生的[12]。天然四倍體泥鰍是我國(guó)特有的、非常珍貴的種質(zhì)資源[13]，不僅為泥鰍優(yōu)良品種的培育提供了理想的原材料，還是研究多倍體脊椎動(dòng)物的生物學(xué)和遺傳學(xué)等的理想模型。鑒于cyp19a1既能調(diào)控魚類的生殖發(fā)育，又能影響魚類的生長(zhǎng)代謝，因此，研究其在二倍體、四倍體泥鰍間的表達(dá)特點(diǎn)，可能對(duì)了解泥鰍倍性間生長(zhǎng)和生殖差異有一定的參考價(jià)值。近期，筆者所在課題組發(fā)現(xiàn)，四倍體泥鰍的生殖發(fā)育明顯滯后于二倍體，在相同的養(yǎng)殖環(huán)境下，二倍體泥鰍1齡即可性成熟并開始繁殖活動(dòng)，而四倍體泥鰍2齡以后才能達(dá)到性成熟。我們推測(cè)，四倍體泥鰍的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)可能與其相對(duì)較晚的生殖發(fā)育有關(guān)。

本研究中，我們選擇12月齡的二倍體、四倍體泥鰍為研究對(duì)象，克隆獲得了泥鰍的cyp19a1a基因cDNA序列和5′側(cè)翼序列，并分析cyp19a1在泥鰍組織間和倍性間的表達(dá)特點(diǎn)和差異，研究其與泥鰍倍性間生長(zhǎng)和生殖差異中的相關(guān)性，進(jìn)而探討四倍體泥鰍性腺發(fā)育較晚的分子機(jī)制，以期為魚類生長(zhǎng)和生殖的調(diào)控關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚來(lái)源

以野生二倍體、四倍體泥鰍為親本，通過(guò)人工繁殖獲得子一代，將其在相同環(huán)境下養(yǎng)殖，隨機(jī)選取12月齡的二倍體、四倍體雌雄個(gè)體各9尾用于本研究。

1.2 DNA和RNA的提取和檢測(cè)

將試驗(yàn)魚用MS-222(100 mg/L)麻醉，測(cè)量體長(zhǎng)、體質(zhì)量后，分離腦、性腺、肌肉及肝臟，在液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱中保存。用醋酸銨/異戊醇法提取各組織的DNA，用Trizol法提取RNA，分別用1%瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)(NanoDrop 2000,USA)檢測(cè)提取DNA和RNA的完整性和濃度。將每3個(gè)個(gè)體的RNA等量混合作為1個(gè)樣本用于后續(xù)的基因表達(dá)分析。

1.3 cyp19a1a基因的全長(zhǎng)CDS和5′側(cè)翼序列克隆

基于筆者所在課題組前期對(duì)泥鰍全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的cyp19a1a部分cDNA序列(GenBank accession No. AB531496.1)，分別設(shè)計(jì)5′RACE和3′RACE引物(表1)，按照試劑盒(TaKaRa,Japan)的說(shuō)明分別克隆其5′-UTR和3′-UTR序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、純化、連接、轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆鑒定后，送武漢擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)確認(rèn)無(wú)誤后，用DNA Star軟件拼接得到cyp19a1a基因的全長(zhǎng)CDS序列。

基于拼接獲得的全長(zhǎng)CDS序列，采用高效熱不對(duì)稱PCR(high-efficient thermal asymmetric interlaced PCR，hiTAIL-PCR)技術(shù)擴(kuò)增泥鰍cyp19a1a的5′側(cè)翼序列。具體方法為：將泥鰍cyp19a1a的CDS序列與斑馬魚的序列比對(duì)推測(cè)其第一外顯子序列，然后在第一外顯子序列上設(shè)計(jì)3條嵌套的特異性引物(special primer,簡(jiǎn)稱SP1,SP2,SP3)作為下游引物，用Liu等[14]的LAD1-5長(zhǎng)隨機(jī)簡(jiǎn)并引物(longer arbitrary degenerate primer)作為上游引物(表1)進(jìn)行連續(xù)3輪PCR擴(kuò)增。其中，第1輪PCR以泥鰍基因組DNA為模板，用SP1特異性引物與LAD1-5兼并引物組合進(jìn)行擴(kuò)增；然后將第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋40倍作為第2輪PCR模板，用SP2與AC1組合擴(kuò)增；隨后將第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍作為第3輪PCR模板，用SP3與AC1進(jìn)行擴(kuò)增。第3輪PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、純化、連接、轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆鑒定后，送武漢擎科生物有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)人工檢查確認(rèn)無(wú)誤后，用DNAStar軟件拼接得到cyp19a1a基因的5′側(cè)翼序列。

1.4 cyp19a1a基因CDS和5′側(cè)翼序列的生物信息學(xué)分析

對(duì)克隆獲得的CDS序列，用BioXM 2.6導(dǎo)出氨基酸序列，用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域，用PROSITE(https://prosite.expasy.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的功能域。然后用Clustal W(2.0)(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)將泥鰍cyp19a1a基因編碼的氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源性比對(duì)。用MEGA X的鄰位相連(neighbor-joining,NJ)法，將泥鰍cyp19a1a基因編碼的氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

用在線軟件NNPP(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預(yù)測(cè)cyp19a1a基因5′側(cè)翼序列的核心元件(promoter core element,PCE)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcript start site,TSS)，用AliBaba 2.1(http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)和Cister(https://zlab.bu.edu/～mfrith/cister.shtml)預(yù)測(cè)5′側(cè)翼序列上潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

1.5 cyp19a1在二倍體、四倍體泥鰍間的表達(dá)差異分析

根據(jù)克隆獲得的cyp19a1a的CDS序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)cyp19a1a的qRT-PCR引物。為了解cyp19a1b與cyp19a1a的表達(dá)差異，本研究根據(jù)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的cyp19a1b部分CDS序列，設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，并用泥鰍的β-actin序列(AB200265.1)設(shè)計(jì)內(nèi)參引物(表1)，比較cyp19a1b與cyp19a1a在泥鰍組織間和倍性間的表達(dá)差異。

將提取的總RNA用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa,Japan)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa,Japan)，以二倍體、四倍體泥鰍各組織的cDNA為模板，在ABI 7500 FAST Real-Time PCR System(Applied Biosystems,USA)上檢測(cè)cyp19a1a和cyp19a1b的表達(dá)水平。用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用單因素方差分析(one-way ANOVA)以及Duncan’ s多重比較進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異顯著，用Origin 9.0軟件作圖。

表1 泥鰍cyp19a1克隆和表達(dá)分析所用的引物 Table 1 Primers used for cloning and expression analysis of cyp19a1 gene in M. anguillicaudatus

2 結(jié)果與分析

2.1 泥鰍cyp19a1a基因的CDS序列特征

泥鰍cyp19a1a基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1 905 bp，包括29 bp的5′UTR序列、301 bp的3′UTR序列和1 575 bp的ORF序列，編碼524個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，序列特征如圖1所示。蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，泥鰍cyp19ala基因編碼的氨基酸序列分別在46～55位有1個(gè)低復(fù)雜度區(qū)(low complexity region)，在67～505位有1個(gè)P450蛋白結(jié)構(gòu)域(Pfam domain)。用PROSITE對(duì)其功能域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在449～458位存在細(xì)胞色素P450半胱氨酸血紅素-鐵配體識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)。此外，通過(guò)與其他物種進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在泥鰍的cyp19a1a基因中也存在芳香化酶的3個(gè)高度保守片段，分別為I-螺旋區(qū)(與類固醇物質(zhì)結(jié)合有關(guān))、芳香化酶特異保守區(qū)以及血紅素結(jié)合區(qū)(圖1)，這表明泥鰍的cyp19a1a基因具有性腺型芳香化酶基因的典型功能。SWISS MODEL軟件對(duì)泥鰍cyp19a1a基因編碼蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角以及延伸鏈構(gòu)成。

方框內(nèi)分別為起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)；綠色區(qū)域:跨膜區(qū)域; 紫色區(qū)域:低復(fù)雜度區(qū); 黃色區(qū)域:I-螺旋區(qū); 紅色區(qū)域:芳香化酶特異保守區(qū); 藍(lán)色區(qū)域:血紅素結(jié)合區(qū); 棕色下劃線區(qū)域:P450蛋白結(jié)構(gòu)域。The start codons (ATG) and stop codons (TGA) are shown in red; green region indicate transmenbrane region,purple region indicate low complexity region,yellow region indicate I-helix region,red region indicate aromatase-specific conserved region,blue region indicate heme-binding region and the underlined with brown indicate Pfam domain.

圖2 預(yù)測(cè)的泥鰍cyp19a1a蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.2 泥鰍cyp19a1a的同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

將泥鰍cyp19a1a的氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物的序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，泥鰍的cyp19a1a與其他魚類的cyp19a1a有較高的同源性，其中，與鯉(Cyprinuscarpio)的同源性最高(80.27%)，其次為鯽(Carassiusauratus)(79.3%)和斑馬魚(Daniorerio)(79.11%)，而與豬(Susscrofa)的同源性最低(50.2%)(圖3)。用MEGA X的NJ分析法，構(gòu)建泥鰍與其他脊椎動(dòng)物cyp19a1a氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，發(fā)現(xiàn)泥鰍與斑馬魚、鯉、鯽等魚類在進(jìn)化上緊密相關(guān)，并形成一個(gè)獨(dú)立的分支，而爬行類的巴西龜(Trachemysscripta)、鳥類的雞(Gallusgallus)、哺乳類的人(Homosapiens)、鼠(Musmusculus)和野豬則形成一個(gè)大的獨(dú)立分枝，且親緣關(guān)系與泥鰍越來(lái)越遠(yuǎn)。這些結(jié)果與氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果相同，也與物種的實(shí)際進(jìn)化關(guān)系相一致。

圖3 不同物種cyp19a1a氨基酸序列比對(duì)

2.3 泥鰍cyp19a1a 5′側(cè)翼序列的生物信息學(xué)分析

用hiTAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到泥鰍cyp19a1a的5′側(cè)翼序列，其長(zhǎng)度為2 040 bp。用NNPP軟件對(duì)啟動(dòng)子的核心元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)一處分值較高的序列(圖5，灰色突出顯示)(Score:0.95)，其中包括典型元件TATA-box(-32～-25)，推測(cè)其為cyp19a1a的啟動(dòng)子核心元件。分別用AliBaba 2.1和Cister對(duì)泥鰍cyp19a1a5′側(cè)翼序列中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到3個(gè)SRF、5個(gè)Sp1、1個(gè)C/EBPβ、1個(gè)SRY、3個(gè)ER、1個(gè)GR等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(圖5)。

圖4 基于氨基酸序列的cyp19a1a基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖5 泥鰍cyp19a1a啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.4 二倍體、四倍體泥鰍的生長(zhǎng)和性腺發(fā)育比較

比較12月齡二倍體、四倍體泥鰍的體長(zhǎng)和體質(zhì)量參數(shù)，結(jié)果顯示，四倍體泥鰍的雌雄個(gè)體均顯著高于二倍體(P<0.05)，表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)(圖6)。卵巢組織的切片結(jié)果顯示，12月齡二倍體泥鰍卵巢主要為成熟期的卵母細(xì)胞(LMO)，為Ⅳ期卵巢，而四倍體泥鰍的卵巢中主要為皮層濾泡期的卵母細(xì)胞(CAO)和早期的卵黃卵母細(xì)胞(EVO)，為Ⅱ期卵巢。精巢組織切片結(jié)果顯示，二倍體泥鰍的精巢中含有大量的精子細(xì)胞(Sz)和少量的精細(xì)胞(St)，為Ⅳ期精巢，而四倍體泥鰍的精巢中含有部分精母細(xì)胞(Sc)和大量的精細(xì)胞(St)，為Ⅲ期精巢(圖7)。

柱形圖上相同字母表示無(wú)顯著性差異(P>0.05)，不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。下同。Same letters on the bar means no significantly different between each other (P>0.05), while different letters means significantly different (P<0.05).The same as below.

PO：初級(jí)卵母細(xì)胞； CAO：皮層濾泡期的卵母細(xì)胞； EVO：早期的卵黃卵母細(xì)胞； LMO：成熟期的卵母細(xì)胞； Sc：精母細(xì)胞； St：精細(xì)胞； Sz：精子細(xì)胞。PO:Primary oocytes； CAO:Cortical-alveolar oocytes； EVO:Early vitellogenic oocytes； LMO:Late/mature oocytes;Sc:Spermatocytes; St:Spermatids; Sz:Spermatozoa.

2.5 cyp19a1a/b在二倍體、四倍體泥鰍組織間的表達(dá)差異分析

qRT-PCR分析結(jié)果顯示，cyp19a1a在二倍體雌性泥鰍的卵巢中表達(dá)水平最高，其次為肌肉和肝臟，在腦中的表達(dá)量最低，但其在雄性二倍體泥鰍肝臟和肌肉中的表達(dá)水平卻顯著高于雌性(P<0.05)(圖8A)。四倍體泥鰍與二倍體的表達(dá)模式基本一致(圖8B)。cyp19a1b在腦中的表達(dá)量顯著高于其他組織，且在雌性中的表達(dá)量顯著高于雄性(P<0.05)(圖8C)。在二倍體泥鰍的肌肉和精巢中也檢測(cè)到cyp19a1b的表達(dá)，但其在肝臟和卵巢中的表達(dá)量很低(圖8C)。與二倍體相比，cyp19a1b在四倍體泥鰍肌肉的表達(dá)量很低，幾乎無(wú)法檢測(cè)到(圖8D)。

2.6 cyp19a1在雌雄泥鰍倍性間的表達(dá)比較

在雌性泥鰍中，cyp19a1a在四倍體泥鰍腦、性腺、肌肉和肝臟4個(gè)組織中的表達(dá)水平都顯著高于二倍體(P<0.05)(圖9A)；而在雄性中，cyp19a1a在性腺中的表達(dá)水平低于二倍體(P>0.05)(圖9B)。在雌性中，cyp19a1b基因在四倍體泥鰍腦中的表達(dá)量顯著高于二倍體(圖9C)，但在雄性中其表達(dá)水平相反(P<0.05)(圖9D)。除此之外，在雌性中，二倍體cyp19a1b在肌肉中的表達(dá)水平高于四倍體(P>0.05)(圖9C)；在雄性中，該基因在性腺、肌肉和肝臟組織中的表達(dá)模式均為二倍體高于四倍體(P>0.05)(圖9D)。

圖8 cyp19a1a(A,B)和cyp19a1b(C,D)在雌雄泥鰍組織間的表達(dá)比較

圖9 cyp19a1a(A,B)和cyp19a1b(C,D)在雌雄泥鰍不同倍性間的表達(dá)

3 討 論

3.1 泥鰍cyp19a1a基因的5′側(cè)翼序列特征

本研究中，我們?cè)谀圉qcyp19a1a基因的5′側(cè)翼序列上預(yù)測(cè)到多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中包括CREB結(jié)合位點(diǎn)，該結(jié)合位點(diǎn)是硬骨魚cyp19a1a啟動(dòng)子的保守特征[15]。在5′側(cè)翼序列上，還發(fā)現(xiàn)有GR(糖皮質(zhì)激素受體)結(jié)合位點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)皮質(zhì)醇(與魚類壓力最直接相關(guān)的激素)的增加可以通過(guò)與cyp19a1a啟動(dòng)子中的GR結(jié)合，下調(diào)cyp19a1a的表達(dá)，從而導(dǎo)致雌二醇(E2)的生成遲緩并最終抑制卵巢分化[16-18]。此外，還發(fā)現(xiàn)有多個(gè)ER轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)E2與ER(雌激素受體)結(jié)合后，可以直接作用于靶基因啟動(dòng)子區(qū)的雌激素應(yīng)答元件，從而發(fā)揮對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[19]。因此，泥鰍cyp19a1a的5′側(cè)翼序列上存在cyp19a1a基因的重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

3.2 二倍體、四倍體泥鰍生長(zhǎng)和性腺發(fā)育的比較分析

比較12月齡的二倍體、四倍體泥鰍的生長(zhǎng)參數(shù)，結(jié)果顯示，四倍體泥鰍的體長(zhǎng)和體質(zhì)量均顯著高于二倍體，具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，這與已有的研究結(jié)果是一致的[11]。同時(shí)，性腺切片的結(jié)果顯示，在雌性和雄性中，四倍體泥鰍的性腺發(fā)育時(shí)期都明顯滯后于二倍體。一般認(rèn)為，生長(zhǎng)和生殖之間存在著相互制約的關(guān)系，生長(zhǎng)和生殖能量的分配存在著一個(gè)平衡[20]，我們推測(cè)，四倍體泥鰍的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)可能與其相對(duì)較晚的性腺發(fā)育有關(guān)。

3.3 cyp19a1在二倍體和四倍體泥鰍組織間的表達(dá)特點(diǎn)

在二倍體、四倍體泥鰍中，cyp19a1a均在卵巢中的表達(dá)量最高，且表達(dá)水平顯著高于精巢(P<0.05)，這是由于較高的cyp19a1a可以加速雌激素的合成，而雌激素在魚類卵巢分化與維持等方面起著至關(guān)重要的作用[21]。與cyp19a1a不同，cyp19a1b在卵巢中幾乎不表達(dá)，在精巢中的表達(dá)相對(duì)較高，這與東非慈鯛(Cichlidae)的研究結(jié)果類似[6]。Robertson等[22]對(duì)小鼠(M.musculus)cyp19a1b進(jìn)行靶向破壞，發(fā)現(xiàn)缺乏芳香化酶的雄性小鼠在4.5個(gè)月到1 a之間會(huì)出現(xiàn)精子發(fā)生中斷的現(xiàn)象。由此推測(cè)，cyp19a1b不僅參與了性腺分化過(guò)程中神經(jīng)內(nèi)分泌和代謝的過(guò)程，對(duì)維持精巢的功能也發(fā)揮了重要的作用[6]。

cyp19a1a在泥鰍腦中的表達(dá)量較低，這與其他魚類中的研究結(jié)果一致[5]，推測(cè)在腦中發(fā)揮主要功能的是cyp19a1b。在金魚(Carassiusauratus)[23]和鯉(C.carpio)[24]中的研究發(fā)現(xiàn)，cyp19a1b集中在基底前腦的生殖控制中心表達(dá)，表明cyp19a1b及其催化產(chǎn)生的雌激素在發(fā)育和生殖過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在斑點(diǎn)叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)的腦中，cyp19a1b活性較高的區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了促性腺激素釋放激素(GnRH)神經(jīng)元(負(fù)責(zé)控制硬骨魚類的性腺成熟)，推測(cè)cyp19a1b可能參與調(diào)節(jié)了腦-垂體-性腺軸(HPG軸)，直接或間接調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌[25]。

在泥鰍的肝臟中也檢測(cè)到了cyp19a1的表達(dá)，尤其是cyp19a1a，且其在雄魚中的表達(dá)量高于雌性。類似的結(jié)果在人(H.sapiens)[26]、鯉[24]中也有報(bào)道。在魚類中，肝臟是性腺源性雌激素作用的主要靶標(biāo)之一[27]，當(dāng)魚類處在卵黃形成的高峰期，肝臟中多量的芳香化酶可以通過(guò)促使循環(huán)血液中的雄激素轉(zhuǎn)化為雌二醇，進(jìn)而刺激肝臟合成卵黃蛋白原[28]。

3.4 cyp19a1在二倍體、四倍體泥鰍間的表達(dá)及其與生長(zhǎng)生殖差異的相關(guān)性

cyp19a1a在卵巢和肝臟中，以及cyp19a1b在腦中的表達(dá)水平均為四倍體高于二倍體，推測(cè)原因可能與四倍體卵巢所處的發(fā)育階段(Ⅱ期)有關(guān)。魚類性別相關(guān)基因的表達(dá)與其性腺分化的發(fā)育階段密切相關(guān)，在烏鱧(Channaargus)[29]和牙鲆(Paralichthysolivaceus)[3]中，均發(fā)現(xiàn)了cyp19a1a在卵巢發(fā)育未成熟時(shí)期的表達(dá)量顯著高于成熟期的現(xiàn)象。推測(cè)其原因可能是由于芳香化酶是將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的限速酶，雌激素可以促進(jìn)肝臟中卵黃蛋白原的產(chǎn)生，刺激卵母細(xì)胞中卵黃物質(zhì)的積累，從而在魚類卵母細(xì)胞的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。當(dāng)卵巢處于分化階段時(shí)，肝臟內(nèi)需要大量的雌激素來(lái)刺激卵黃蛋白原生成，為正在發(fā)育的卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和功能性物質(zhì)[28]，而芳香化酶是雌激素產(chǎn)生的必要條件，因此，此時(shí)cyp19a1a在四倍體泥鰍肝臟中的表達(dá)量也較高。Goto-Kazeto等[25]研究發(fā)現(xiàn)，腦中的cyp19a1b可能參與調(diào)節(jié)了腦-垂體-性腺軸(HPG軸)，進(jìn)而調(diào)節(jié)硬骨魚的性腺分化，此時(shí)四倍體泥鰍的卵巢處于發(fā)育階段，需要大量的類固醇激素來(lái)促進(jìn)自身的性腺發(fā)育，所以此時(shí)cyp19a1b在四倍體腦中的表達(dá)量較高。cyp19a1a在二倍體泥鰍精巢中的表達(dá)量低于四倍體(P>0.05)，可能與四倍體泥鰍精巢所處的發(fā)育階段有關(guān)，Kitano等[30]認(rèn)為，精巢中cyp19a1a的低表達(dá)是精巢分化的先決條件。

生長(zhǎng)參數(shù)及性腺組織學(xué)比較結(jié)果顯示，與二倍體泥鰍相比，四倍體泥鰍生長(zhǎng)快，但性成熟明顯滯后；組織間和倍性間的基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，cyp19a1a在四倍體泥鰍各組織中的表達(dá)量均高于二倍體(除精巢外)。由于芳香化酶及其催化產(chǎn)生的雌激素，不僅在魚類的性別決定中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，還可以通過(guò)GH-IGF通路調(diào)節(jié)魚類的生長(zhǎng)發(fā)育。由此，我們推測(cè)，四倍體泥鰍高表達(dá)的cyp19a1a可以通過(guò)影響IGF/GH生長(zhǎng)軸相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)而促進(jìn)四倍體泥鰍的生長(zhǎng)。