莫 婷，何 婷，徐 靜，楊麗娟，楊 森，火明才，康菊英，盧海瑞，馬 力

（1. 寧夏回族醫(yī)藥研究所，寧夏 銀川750021； 2. 寧夏中醫(yī)醫(yī)院暨中醫(yī)研究院，寧夏 銀川 750021）

雞娃草為白花丹科雞娃草屬植物雞娃草Plumbagella micrantha（Ledeb.） Spach的全草，又名小藍雪花、刺礬松、藍雪草等，是雞娃草屬唯一品種，與白花丹屬親緣關(guān)系最近[1]。雞娃草在我國西北、西南地區(qū)分布廣泛，生于海拔2 000 ～ 3 500 m的山坡和田間。在寧夏省六盤山、南華山地區(qū)主要生長在鹽堿性地帶[2]。有文獻記載在俄羅斯西伯利亞阿爾泰邊疆地區(qū)及烏克蘭克里米亞半島的南部海岸地區(qū)亦有分布[3-4]。長期以來，寧夏地區(qū)民間常用雞娃草治療濕疹、手廯、足廯、神經(jīng)性皮炎等癥[5]，該藥材性寒，味苦，歸肺經(jīng)，具有解毒、止癢、殺蟲的功效，鮮品外用治療各種皮膚癬，以及疣痣、惡肉等病癥具有奇特療效[2]。但是，雞娃草缺乏相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準，在歷版《中國藥典》及各地方標(biāo)準中均未收載，且沒有指標(biāo)性成分用于該藥材的鑒別與質(zhì)量控制。

有報道發(fā)現(xiàn)雞娃草中除了含有白花丹科常見的花色苷、山柰苷和槲皮苷等黃酮苷類化合物以外[6-7]；還含有以白花丹素（5-hydroxy-2-methyl-l,4-naphthoquinone, C11H8O3） 為代表的α-萘醌類成分。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)白花丹素具有顯著的抗炎、抗菌活性，并對多種癌細胞增殖具有抑制作用[8-16]，與雞娃草藥材解毒、止癢、殺蟲的功效接近，是雞娃草的主要藥效物質(zhì)之一。因此，本研究在文獻調(diào)研的基礎(chǔ)上，首次選擇白花丹素為雞娃草的指標(biāo)性成分，初步探索了雞娃草藥材的質(zhì)量標(biāo)準研究方法，包括性狀、顯微、薄層色譜鑒別及白花丹素成分的定量方法，為控制雞娃草的藥材質(zhì)量和進一步開發(fā)利用及擴大藥用資源提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）； DM3000型光學(xué)顯微鏡（德國徠卡公司）；ME204型萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；74-05332型鼓風(fēng)干燥箱（德國賓德公司）；P/N560-01302-00型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦有限公司）；SX2-10-13型馬弗爐（上海樹立儀器儀表有限公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ZF-8型暗箱式紫外分析儀（上海勤科分析儀器有限公司）。

1.2 材料

白花丹素對照品（成都普瑞法生物科技開發(fā)有限公司，純度 > 98%，批號：PRF8032121）；甲醇［色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；其它試劑均為分析純，水為超純水；硅膠板（青島海洋化工廠分廠，G100×100mm）。雞娃草藥材分別采自寧夏固原市六盤山區(qū)、涇源縣及隆德縣等城區(qū)，經(jīng)寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院李小偉副教授鑒定為白花丹科植物雞娃草Plumbagella micrantha（Ledeb.） Spach的全草。

2 方法及結(jié)果

2.1 性狀鑒別

本品為雞娃草的干燥全草，根細長圓柱形，略微彎曲，較多分枝，表面紅棕色或灰褐色，上端著生多數(shù)細根。莖直立或斜上，有條棱，沿棱有稀疏小皮刺，多分枝，綠色或紫紅色，質(zhì)輕，易折斷，斷面皮部纖維狀，髓部類白色，海綿狀，松軟；葉片完整者展平后呈倒卵狀披針形或披針形，多皺縮破碎，基部箭形或耳形而抱莖，先端漸尖，上面綠色或紅紫色，下面灰綠色或淡紅紫色；穗狀花序頂生，等筒狀；花粉紅色或淡藍紫色；氣微；味淡。

2.2 顯微鑒別

粉末特征：粉末呈棕綠色或紅棕色。葉上表皮細胞多角形，垂周壁較平直；下表皮細胞類長方形，垂周壁微波狀彎曲狀；氣孔不等式，副衛(wèi)細胞2 ～ 3個。網(wǎng)紋導(dǎo)管、梯紋導(dǎo)管多見，環(huán)紋或螺紋導(dǎo)管少見，直徑5 ～ 35 μm。木纖維成束，多亮黃色，壁薄或微木化，直徑8 ～ 12 μm。韌皮纖維棕綠色，長梭形，頂端尖，壁增厚，直徑10 ～ 20 μm。石細胞單個散在或成群，類方形、類長方形、多角形或紡錘形，黃綠色，直徑20 ～ 50 μm，壁厚。分泌道內(nèi)含紅棕色分泌物，存在于植物根部。非腺毛具1 ～ 10余個細胞，多平直、頂端鈍圓，少數(shù)頂端細胞皺縮扭曲。草酸鈣簇晶散在，直徑10 ～ 25 μm?；ǚ哿ｎ悎A形，直徑20 ～ 30 μm，數(shù)目較多，表面光滑，具3 ～ 4個萌發(fā)孔。油細胞含黃色或紅黃色油狀物，類方形、類長方形或類圓形。分泌細胞成束，長條狀，內(nèi)含淡紫色或黃白色分泌物，直徑8 ～ 10 μm。棕色塊多數(shù)，紅棕色，不規(guī)則，見圖1。

2.3 薄層色譜TLC鑒別

按照薄層色譜法（《中國藥典》2020版四部通則0502）試驗，吸取供試品和對照品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸（8∶1∶1）為展開系統(tǒng)，展開后取出，晾干。供試品色譜中，在與對照品相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的淺黃色斑點，紫外燈254、302、365 nm下均顯棕黃色斑點。薄層板置于氨水蒸氣中熏至斑點變色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫色斑點，見圖2。

圖2 雞娃草藥材薄層色譜圖Fig.2 TLC chromatograms of Plumbagella micrantha

2.4 水分、灰分和醇溶性浸出物測定

6批樣品醇溶性浸出物測定、水分測定、灰分測定分別按《中國藥典》2020版四部通則“2201浸出物測定法”項下冷浸法及醇溶性浸出物測定法、通則“0832水分測定法”項下烘干法、通則“2302灰分測定法”項下總灰分測定法及酸不溶性灰分測定法進行測定，結(jié)果見表1。

表1 6批雞娃草各指標(biāo)測定結(jié)果Tab.1 The measurement results of various indicators of 6 batches Plumbagella micrantha

2.5 白花丹素含量測定

2.5.1色譜條件 按照高效液相色譜法（《中國藥典》2020版四部通則0512），采用安捷倫Agilent 1260 ChemStation工作站；色譜柱為Phenomenex luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水溶液 （70∶30） 等度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測器為二極管陣列檢測器，圖3中供試品溶液和白花丹素對照品溶液的波峰均在268 nm附近，可選擇作為檢測波長；柱溫：25℃；進樣量：10 μL 。

2.5.2對照品溶液的制備 精密稱取白花丹素對照品0.002 9 mg 置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容至10 mL，精密量取1.0 mL該溶液至10 mL容量瓶中，甲醇定容至10 mL，搖勻，配制成每1.0 mL含29.0 μg的白花丹素對照品溶液。

2.5.3供試品溶液的制備 雞娃草全草藥材粉末過2號篩，精密稱定1.0 g置于100 mL具塞錐形瓶中，加入15 mL甲醇，超聲提取30 min后取出，冷卻后用甲醇補足質(zhì)量，搖勻，濾過，取濾液過0.22 μm 濾膜，作為供試品溶液。

2.5.4系統(tǒng)適應(yīng)性 考察發(fā)現(xiàn)，按照“2.5.2”“2.5.3”項下方法進行配制，并在上述色譜條件下，白花丹素在9.4 min出峰，且峰形對稱、尖銳。雞娃草全草供試品色譜和白花丹素對照品色譜在相同的保留時間上有對應(yīng)的吸收峰，與其它峰的分離度良好，且均在268 nm處有最大紫外吸收，表明系統(tǒng)適應(yīng)性良好，見圖3。

圖3 白花丹素對照品及雞娃草全草供試品色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of plumbagin and Plumbagella micrantha

2.5.5線性關(guān)系考察 分別精密吸取白花丹素對照品溶液按“2.5.1”項下色譜條件依次進樣1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品進樣量 （μg） 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線，得回歸方程：Y=5 452.9X－7.809 8，R2= 0.999 9。結(jié)果表明，白花丹素在0.029 0 ～ 0.290 0 μg 進樣量范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.6精密度試驗 按“2.5.1”項下色譜條件重復(fù)進樣白花丹素對照品溶液（0.029 0 mg/mL）6次，進樣量為10 μL，測得峰面積，RSD 值為0.98%，表明儀器精密度良好。

2.5.7重復(fù)性試驗 取同一批次的雞娃草全草藥材粉末6份，按照“2.5.3”項下方法平行配制6份供試品溶液，并按“2.5.1”項下色譜條件進樣10 μL，測定白花丹素的峰面積，RSD值為1.06%。

2.5.8穩(wěn)定性試驗 取雞娃草全草藥材按照“2.5.3”項下方法配制，并按“2.5.1”項下色譜條件分別在制備后0、2、4、8、10、24 h進樣測定，測定白花丹素峰面積的RSD值為0.73%，表明樣品溶液避光放置在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.5.9加樣回收率試驗 取已知含有量的雞娃草全草藥材粉末樣品 （批號：20200915YBQ-2） 約1.0 g，共9份，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，再精密稱取白花丹素對照品0.007 9 g，按“2.5.2”項下制備成每1 mL含7.9 mg的對照品溶液，分別精密吸取該對照品溶液81、102和122 μL各三份于相應(yīng)的錐形瓶中。按“2.5.3”項下制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，加樣回收率平均值為99.82%，RSD為1.97%。

2.5.10樣品測定 取10批雞娃草樣品，精密稱定，分別按上述條件制備供試品溶液和進樣測定，計算含量，結(jié)果見表2。

表2 雞娃草不同采收批次含量測定結(jié)果Tab. 2 Determination results of different batches of Plumbagella micrantha

此外，從雞娃草藥材中選取綠色的根、莖、葉，以及隨著季節(jié)變換，植物自然生長逐漸變?yōu)榧t色后的根、莖、葉，各3批，分別精密稱取藥材粉末，考察雞娃草不同顏色不同藥用部位中白花丹素的含量差異。按“2.5.1”和“2.5.3”項下方法進行測定，計算雞娃草不同顏色不同部位中白花丹素的含量，結(jié)果見表3。

表3 雞娃草不同顏色不同部位含量測定結(jié)果Tab. 3 Determination results of different medicinal parts and colors of Plumbagella micrantha

3 討論

雞娃草植物在寧夏分布較為廣泛，多集中在固原市六盤山地區(qū)，野生資源豐富，但目前市售多為雞娃草浸膏和提取物，無原藥材售賣，因此本研究所用10 個批次的樣品均為寧夏南部地區(qū)的野生雞娃草藥材，對其進行了性狀及顯微鑒別，發(fā)現(xiàn)藥材性狀特征基本一致，顯微特征穩(wěn)定，TLC鑒別結(jié)果顯示分離度、斑點相對位置和重復(fù)性較好。此外，在不同波長的紫外燈下，還觀察到其它多個不同顏色的清晰斑點，提示雞娃草中的化學(xué)成分值得進一步研究。根據(jù)研究結(jié)果初步擬定：雞娃草藥材（寧夏地區(qū)）水分不得超過6.0%；總灰分不得超過15.0%；酸不溶性灰分不得超過8.0%；醇溶性浸出物不得少于2.0%。本研究還建立了雞娃草藥材中白花丹素的HPLC定量測定的方法，對10批雞娃草藥材全草進行了定量分析，結(jié)果表明各樣品均可檢出白花丹素，且含量有一定的差異。此外，考察發(fā)現(xiàn)雞娃草藥材根、莖、葉中白花丹素的含量差異較為顯著，且隨著季節(jié)變換，藥材性狀由綠色逐漸變?yōu)榧t色后，白花丹素在根、莖、葉中的含有量高低分布也隨之變化，綠色藥材根中的白花丹素含量最高，而紅色藥材葉中的白花丹素含量最高，這可能與其適應(yīng)自然環(huán)境體內(nèi)正常的產(chǎn)物分布和代謝有關(guān)。根據(jù)實驗結(jié)果，綜合藥材的來源、采收季節(jié)及存放等原因，初步擬定雞娃草藥材全草白花丹素含量應(yīng)不得少于0.07%。

4 結(jié)論

本實驗對雞娃草質(zhì)量標(biāo)準進行了研究，建立的定性、定量方法靈敏度高、重復(fù)性好，較為精確和簡便，可為今后雞娃草質(zhì)量標(biāo)準的進一步完善奠定基礎(chǔ)，并為其藥材的進一步開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。此外，雞娃草的藥用價值及療效雖然已為民間所證實，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理活性機制尚不明確，值得深入研究。