王 巍，索天嬌，張 強(qiáng)，王 雪，劉佳欣，鞠成國

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根，收載于《中國藥典》2020年版（一部）。其味苦、性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎之功效[1]。《中國藥典》中“黃芩”項(xiàng)下收錄2個飲片品種，即黃芩片和酒黃芩，鑒別方法同黃芩藥材，采用顯微鑒別和薄層色譜鑒別，其中薄層色譜鑒別是以黃芩對照藥材及黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素為指標(biāo)；采用高效液相色譜法測定黃芩苷含量，要求藥材中不低于9.0%，兩種飲片中黃芩苷含量均不低于8.0%。眾所周知，炮制對中藥化學(xué)成分具有多重影響[2]，且不同炮制方法的影響可能具有較大差異，因而不同炮制品應(yīng)根據(jù)具體情況建立相應(yīng)質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)。鑒于黃芩可清熱燥濕、瀉火解毒，又兼具止血之效，因此臨床常用于潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）的治療，如《傷寒論》中黃芩湯為治療UC的基礎(chǔ)方劑之一[3]。本試驗(yàn)以黃芩片、酒黃芩、黃芩炭3個炮制品種為研究對象，建立定性鑒別及含量測定方法，并結(jié)合水分、灰分、醇溶性浸出物含量對3個品種的質(zhì)量進(jìn)行比較；并以6%醋酸誘導(dǎo)小鼠UC模型，比較3個品種抗UC的療效差異。為黃芩不同飲片品種的質(zhì)量控制及臨床安全合理用藥提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Multiskan Mk 3型酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；ZF-20D型暗箱式紫外分析儀（鞏義市科瑞儀器有限公司）。

1.2 試劑

黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品及黃芩對照藥材（批號：110715-201821、111595-201607、111514-201706、120955-201710，中國食品藥品檢定研究院）；漢黃芩苷（批號：O0903AS，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；小鼠超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、白細(xì)胞介素10（IL-10）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒（批號：F2389-A、F9261-A、F2176-A、F2040-A、F2132-A，上?？婆d生物科技有限公司）；烏拉坦（批號：E8710，北京索萊寶科技有限公司）；甲醇為色譜純，醋酸為分析純（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水。

1.3 試藥

黃芩購自遼寧省朝陽市建平縣GAP基地，秋季采挖，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張慧教授鑒定為黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根。黃芩片：取黃芩藥材煮制10 min，取出，稍涼，切2 mm的厚片，在60℃下干燥1 h，即得[4]；酒黃芩：取黃芩片，均勻拌入10%黃酒，悶潤至黃酒吸盡，于100 ～ 110℃炒制7 min，取出，晾涼即得；黃芩炭：取黃芩片，于180 ～ 190℃炒制7 min，取出，晾涼即得。美沙拉秦（批號：20200901，黑龍江天宏藥業(yè)）。

1.4 動物

昆明小鼠，SPF級，雌雄各半［遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（遼）2020-0001］，體質(zhì)量為（20 ± 2）g。

2 方法與結(jié)果

2.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P< 0.05表示具有顯著性差異，P< 0.01表示具有極顯著性差異。

2.2 黃芩3種飲片質(zhì)量比較

照《中國藥典》2020年（一部）“黃芩”項(xiàng)下鑒別、水分、總灰分及浸出物要求操作，對黃芩3種炮制品進(jìn)行定性鑒別及水分、總灰分、醇溶液浸出物的測定。結(jié)果顯示各樣品與對照圖譜對比相應(yīng)位置斑點(diǎn)清晰，分離度較好，見圖1。黃芩片、酒黃芩、黃芩炭的水分測定均值分別為8.58%、6.56%、1.46%；總灰分測定均值分別為5.32%、5.06%、5.84%；醇溶性浸出物含量測定均值分別為7.65%、51.63%、45.68%。

圖 1 黃芩不同飲片品種薄層鑒別圖Fig.1 TLC identification of different processed varieties of Scutellaria baicalensis

2.3 含量測定

2.3.1色譜條件 色譜柱Diamonsil Plus C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-0.2%磷酸水（B），梯度洗脫（0 ～ 17 min，47%A；17 ～20 min，47% ～ 70%A；20 ～ 25 min，70% ～100%A）；檢測波長：280 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2對照品溶液制備 精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素，加甲醇配制成濃度為0.224、0.293、0.320、0.233 mg/mL的對照品儲備液，備用。

2.3.3供試品溶液制備 分別精密稱取過65目篩的黃芩片、酒黃芩及黃芩炭粉末各0.3 g，加70%乙醇40 mL，加熱回流3 h，放冷，濾液濾至100 mL容量瓶中，并以少量提取溶劑分次洗滌容器和殘?jiān)匆簽V入同一容量瓶中，以70%乙醇定容至刻度，搖勻。再精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3.4方法學(xué)考察 取黃芩片供試品溶液及對照品溶液按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作。結(jié)果顯示4種成分均與相鄰色譜峰分離度良好，理論塔板數(shù)按黃芩苷計(jì)不低于3 000；精密度試驗(yàn)表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)表明樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定；重復(fù)性試驗(yàn)表明方法重復(fù)性良好；線性范圍考察表明黃芩苷在0.041 8 ～0.418 1 μg（Y= 3.4×106X－2.8×104，r= 0.999 9）；漢黃芩苷在0.007 8 ～ 0.078 1 μg（Y= 3.2×106X－1.0 ×104，r= 0.999 7）；黃芩素在0.008 5 ～ 0.085 μg（Y=5.4 × 106X－2.3 × 104，r= 0.999 5）；漢 黃芩素在0.007 8 ～ 0.078 1 μg（Y= 4.7×106X－1.3 × 104，r=0.999 8）與峰面積呈良好線性關(guān)系。黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的平均回收率分別為98.6%、97.9%、97.6%、98.1%，RSD分別為1.4%、0.86%、1.1%、1.3%，均符合相關(guān)規(guī)定。

2.3.5樣品含量測定 取黃芩藥材，制備3批黃芩片，及相應(yīng)的3批酒黃芩和3批黃芩炭，采用雙樣雙針法測定4種成分的含量。結(jié)果見表1。

表1 樣品含量測定結(jié)果（± s, n = 12）Tab.1 Results of the sample content（± s, n = 12）

表1 樣品含量測定結(jié)果（± s, n = 12）Tab.1 Results of the sample content（± s, n = 12）

注：與黃芩片比較， **P＜0.01；與酒黃芩比較，##P＜0.01；與黃芩炭比較， ΔΔP＜0.01

樣品 黃芩苷含量/% 漢黃芩苷含量/% 黃芩素含量/% 漢黃芩素含量/% 總含量/%黃芩片 12.13 ± 0.80##ΔΔ 1.891 ± 0.12##ΔΔ 0.645 5 ± 0.051ΔΔ 0.166 9 ± 0.019##ΔΔ 14.83 ± 0.97##ΔΔ酒黃芩 12.99 ± 0.35**ΔΔ 2.033 ± 0.035**ΔΔ 0.681 3 ± 0.089ΔΔ 0.193 6 ± 0.004 2**ΔΔ 15.90 ± 0.43**ΔΔ黃芩炭 5.853 ± 0.032**## 0.648 3 ± 0.009 4**## 4.048 0 ± 0.47**## 0.952 0 ± 0.010**## 11.50 ± 0.48**##F 720.701 1 384.265 595.212 15 484.440 140.421 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 黃芩3種飲片抗?jié)冃越Y(jié)腸炎效果比較

2.4.1給藥液制備 取黃芩3種飲片粉碎，過200目篩，稱取適量，分別加蒸餾水配成濃度為0.065 g/mL的混懸液，備用；取美沙拉秦腸溶片刮去包衣，研細(xì)，稱取適量，加水混勻，制成濃度為0.02 g/mL的美沙拉秦混懸液，備用。

2.4.2造模及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為美沙拉秦組、黃芩片組、酒黃芩組、黃芩炭組及空白和模型，每組10只。參考文獻(xiàn)[5]加以改進(jìn)以6%醋酸建立小鼠UC模型，小鼠禁食不禁水24 h后，腹腔注射20%烏拉坦麻醉，倒置，在肛門3 ～ 4 cm處，一次性注入0.1 mL的6%醋酸，捏住肛門計(jì)時20 s，再以同法注入2 mL生理鹽水沖洗，放回鼠籠，靜躺至清醒，模型即成。造模24 h后各給藥組以0.4 mL/20 g的劑量灌胃相應(yīng)給藥液，空白組和模型組灌胃等量蒸餾水，每日給藥1次，連續(xù)7 d[6]。

2.4.3一般體征的改變 實(shí)驗(yàn)前各組小鼠體重?zé)o顯著差異，糞便均無隱血。實(shí)驗(yàn)7 d后，模型組小鼠體重較空白組下降，各給藥組較模型組升高；空白組小鼠隱血檢測依舊顯陰性，各給藥組顯陽性，模型組肉眼可見血便。DAI評分=體重增長率× 0.5 +糞便隱血評分× 0.5；體重增長率≥10%，糞便隱血呈陰性計(jì)0分，0≤體重增長率＜10%，糞便隱血呈陽性計(jì)1分，體重增長率＜0，肉眼可見血便計(jì)2分。末次給藥后小鼠禁食不禁水24 h，摘取一側(cè)眼球取血，離心15 min（3 000 r/min），吸取上清備用[7]。取血完畢立即脫頸處死小鼠，解剖結(jié)直腸，測量長度，稱量質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。結(jié)果顯示模型組小鼠較空白組結(jié)腸長度縮短，質(zhì)量增高，各給藥組不同程度改善DAI評分。各組小鼠實(shí)驗(yàn)7 d后結(jié)直腸長度及臟器指數(shù)結(jié)果，見表2。

表2 各組小鼠DAI評分、結(jié)直腸長度及臟器指數(shù)（± s, n = 10）Tab. 2 DAI scoring results, colon length and organ index of mice in each group（± s, n = 10）

表2 各組小鼠DAI評分、結(jié)直腸長度及臟器指數(shù)（± s, n = 10）Tab. 2 DAI scoring results, colon length and organ index of mice in each group（± s, n = 10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 DAI評分結(jié)果 結(jié)直腸長度/cm 結(jié)直腸指數(shù)/×10-2模型組 1.45 ± 0.28## 8.70 ± 0.69## 1.79 ± 0.16##空白組 0.00 ± 0.00** 10.95 ± 0.81** 1.44 ± 0.08**陽性藥組 0.30 ± 0.26**# 10.88 ± 0.76** 1.57 ± 0.07**#黃芩片組 0.14 ± 0.24** 10.04 ± 0.37*# 1.52 ± 0.07**酒黃芩組 0.38 ± 0.23**## 10.20 ± 0.81* 1.54 ± 0.05**黃芩炭組 0.44 ± 0.32**## 10.33 ± 0.65** 1.60 ± 0.09*#F 37.081 8.612 8.704 P 0.000 0.000 0.000

2.4.4病理學(xué)改變 選取病變嚴(yán)重處進(jìn)行切片，HE染色，觀察組織病理改變。結(jié)果可見空白組結(jié)腸組織完整，無明顯病變；模型組結(jié)腸隱窩損傷嚴(yán)重，粘膜下層水腫，局部可見紅細(xì)胞，有炎性細(xì)胞浸潤；各給藥組腺體隱窩結(jié)構(gòu)修復(fù)，排列整齊，少量炎性細(xì)胞浸潤，其中美沙拉秦組最好，其次為酒黃芩組，黃芩片與黃芩炭組稍差，結(jié)果見圖2。

圖2 各組小鼠組織學(xué)變化Fig.2 Histological changes in mice of each group

2.4.5血清中細(xì)胞因子的改變 采用ELISA法，按SOD、MDA、IL-10、IL-1β、TNF-α試劑盒說明操作，對小鼠血清進(jìn)行指標(biāo)測定。結(jié)果顯示模型組小鼠較空白組SOD、IL-10水平降低，MDA、IL-1β、TNF-α水平升高。各給藥組均有改善，見表3。

表3 各組小鼠血清細(xì)胞因子水平（± s, n = 10）Tab. 3 Serum cytokine levels of mice in each group（± s, n = 10）

表3 各組小鼠血清細(xì)胞因子水平（± s, n = 10）Tab. 3 Serum cytokine levels of mice in each group（± s, n = 10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 SOD/（ng/mL） MDA/（nmol/mL） IL-1β/（pg/mL） IL-10/（pg/mL） TNF-α/（ng/mL）模型組 2.28 ± 0.92# 36.10 ± 1.25## 544.75 ± 28.38# 378.98 ± 15.72## 1.13 ± 0.02##空白組 4.74 ± 0.78* 27.97 ± 0.89** 475.14 ± 7.78* 655.74 ± 31.25** 0.89 ± 0.00**陽性藥組 4.21 ± 0.24* 29.89 ± 1.07** 477.94 ± 27.93* 508.84 ± 51.58*# 0.90 ± 0.03**黃芩片組 4.45 ± 0.23* 30.08 ± 1.84** 481.64 ± 11.13* 641.57 ± 93.50** 0.95 ± 0.01**#酒黃芩組 4.36 ± 0.28* 29.95 ± 0.31* 494.94 ± 25.53* 645.69 ± 31.48** 0.96 ± 0.02**#黃芩炭組 4.42 ± 0.67* 30.54 ± 2.96* 481.94 ± 32.74* 694.04 ± 39.53** 0.98 ± 0.04**#F 5.854 12.761 4.035 18.904 38.409 P 0.011 0.000 0.020 0.000 0.000

3 討論

TLC鑒別可見黃芩炭色譜中黃芩苷、漢黃芩苷斑點(diǎn)顏色略淺于黃芩片和酒黃芩，而黃芩素和漢黃芩素斑點(diǎn)顏色顯著加深，證明炒炭過程黃芩苷和漢黃芩苷顯著向黃芩素和漢黃芩素轉(zhuǎn)化。3種不同飲片含水量具有顯著差別，總灰分及醇溶性浸出物含量無顯著差別?！吨袊幍洹?020年版（一部）中規(guī)定黃芩藥材水分不得超過12.0%，總灰分不得超過6.0%，醇溶性浸出物含量不得少于40.0%。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，可暫定黃芩片的水分不得超過10.0%，總灰分不得超過6.0%，酒黃芩的水分不得超過8.0%，總灰分不得超過6.0%，黃芩炭的水分不得超過3.0%，總灰分不得超過8.0%，三中飲片的醇溶性浸出物含量均不得少于40.0%。

黃芩片、酒黃芩中測得的黃芩苷含量均高于12.0%，符合《中國藥典》2020年版（一部）中不得少于8.0%的規(guī)定。在炮制過程中，黃芩苷、漢黃芩苷會向其相應(yīng)的苷元黃芩素和漢黃芩素轉(zhuǎn)化，炮制方法不同轉(zhuǎn)化程度亦不相同。本試驗(yàn)以黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素總量為指標(biāo)，既能提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性，又能體現(xiàn)出不同炮制品種質(zhì)量的差異。根據(jù)本試驗(yàn)測定結(jié)果可暫定黃芩片和酒黃芩中四種組分總量不得少于10.0%，黃芩炭中不得少于8.0%。

抗UC實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃芩不同炮制品均具有顯著療效。綜合來看黃芩片效果更佳，但黃芩片中四種成分含量及醇溶性浸出物含量均不及酒黃芩，說明黃芩治療UC不是某幾個成分的簡單作用效果。黃芩常常應(yīng)用于胃腸道疾病，有文獻(xiàn)[8]報道黃芩多糖可有效治療DSS誘導(dǎo)的小鼠UC，但是，多糖在黃芩藥材中含量并不高。因此黃芩治療UC的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

中藥根據(jù)炮制方法的不同將得到不同的飲片品種，在炮制品過程中，由于工藝參數(shù)的區(qū)別，對所含化學(xué)成分會產(chǎn)生不同程度的影響，故在建立各飲片品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時應(yīng)從實(shí)際情況出發(fā)，建立各自適宜的質(zhì)量評價體系。本試驗(yàn)依據(jù)測定結(jié)果初步建立了黃芩3種炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并比較了其治療UC的效果，為黃芩質(zhì)量控制及臨床合理用藥提供理論依據(jù)，但黃芩各炮制品治療UC的具體機(jī)制還需深入研究。