雷 霞，佟玉良，趙德萍，崔 悅，張 寧,3*，肖洪彬1,*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 博士后流動站，黑龍江 哈爾濱150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；3. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；4. 佳木斯大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007)

隨著全球老齡化社會的到來，阿爾茲海默癥（AD）將成為影響人類生存質(zhì)量的重要疾病。大量研究結(jié)果表明海馬體淀粉樣蛋白（Aβ）異常沉積、Tau過度磷酸化是AD典型的病理特征[1]，但是AD的發(fā)病原因和具體機(jī)制目前尚不明晰。老年女性的癡呆發(fā)病率是老年男性的2倍，與更年期相關(guān)的雌激素降低可能是一個重要誘因。基于臨床樣本的研究也顯示了遲發(fā)性AD風(fēng)險存在性別差異[2]。適當(dāng)?shù)拇萍に靥娲煼ú粌H可以改善AD患者的認(rèn)知功能，還能有效預(yù)防AD的發(fā)生。植物雌激素能夠選擇性地與腦雌激素受體β（ERβ）結(jié)合，對雌激素受體α（ERα）的選擇性較低，因此，在展現(xiàn)出良好的神經(jīng)元保護(hù)作用的同時，不會引起雌二醇類似的副作用[3]。

柚皮苷是一種來源廣泛的植物雌激素，在橘科植物的皮或中藥材中都有大量的分布[4-5]。柚皮苷對多種癡呆動物模型的認(rèn)知功能都有顯著的改善作用[6]。本實(shí)驗將對柚皮苷改善學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制進(jìn)行深入研究，驗證柚皮苷是否通過ER-P38/MAPK信號，調(diào)節(jié)Aβ代謝，對海馬體神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用，為證明柚皮苷抗AD的有效性提供依據(jù)，為開發(fā)植物雌激素抗AD的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗動物

昆明小鼠75只，8月齡，雄性，清潔級，體質(zhì)量為（22 ± 2）g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，合格證號：SCXK（遼）2018-0001。正常飼料，自由進(jìn)水進(jìn)食。實(shí)驗流程均符合黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物管理委員會的要求，并通過實(shí)驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑

柚皮苷（北京百靈威科技有限公司，L750N46）；亞硝酸鈉（天津科密歐，01-25-12）；鹽酸多奈哌齊（源 葉 生 物，S60449）；ICI182780（TOCRIS）購于安諾倫生物；Anti-ERβ（bs-0116R）、Anti-pp38MAPK抗體（bs-2210R）、兔抗β-actin多克隆抗體（bs-0061R）、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（bs-0295GHRP）、兔抗 Anti-APPBP1（bs-12503R）等購于北京博奧森；BACE 1（5606T）、兔抗ERα多克隆抗體 （Cell Signaling，644T）、預(yù)染Marker（P0069）等購于美國CST公司。

1.3 實(shí)驗儀器

ZH-Morris型水迷宮程序自動控制儀（正華生物儀器設(shè)備有限公司）；MiniPROTEANTetra Cell型電泳儀（BIO-RAD公司）；HT7700型透射電鏡（日立儀器有限公司）；Trans-Blot SD Cell型半干轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD公司）；SmartChemi500型化學(xué)發(fā)光成像儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)）。

2 方法

2.1 分組及給藥

75只小鼠隨機(jī)分為5組，空白組（Control）、模 型 組（Model）、陽 性 藥 組（Positive）、柚 皮苷 組（Naringin）、柚 皮 苷+ER阻 斷 劑（NG +ICI182780）組。Control組及Model組灌胃給予蒸餾水；Positive組、Naringin組灌胃分別給予雌二醇（20 mg/kg·d）及柚皮苷（100 mg/kg·d），NG +ICI182780組先腹腔注射ICI182780 （0.072 mg/kg·d），15 min后給予柚皮苷。

2.2 造模

第22天除空白組腹腔注射生理鹽水外，其余組連續(xù)7 d腹腔注射等量的亞硝酸鈉，每日100 mg/kg，第29天開始，每日給藥后30 min進(jìn)行行為學(xué)試驗。

2.3 行為學(xué)檢測

采用新物體識別實(shí)驗、Morris水迷宮定位航行實(shí)驗及空間探索實(shí)驗觀察小鼠認(rèn)知能力。識別指數(shù)=（Tn-Tf）/（Tn+Tf）。記錄動物對新物體的接觸時間為（Time new，Tn）和對舊物體的接觸時間（Time familiar，Tf）。

2.4 取材

行為學(xué)測試后當(dāng)天下午取材，小鼠采用1%戊巴比妥鈉（0.01 mL/g）腹腔注射實(shí)施麻醉，小鼠進(jìn)入麻醉外科期深度時快速斷頭，取出鼠腦組織中海馬體及下丘腦，病理學(xué)方法檢測海馬體及下丘腦形態(tài)和ER受體的表達(dá)。取出的海馬體及下丘腦常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋，切片，HE染色。透射電鏡固定，脫水、浸透、包埋及切片后，電鏡下觀察小鼠海馬體超微結(jié)構(gòu)變化并拍攝。采用Motic Med 7.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計算。另一半海馬體液氮速凍后蛋白提取，蛋白濃度測定按照BCA試劑盒說明書操作，計算各組樣品的蛋白濃度，蛋白印跡法觀察蛋白質(zhì)變化。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)測試結(jié)果

新物體識別實(shí)驗測試結(jié)果如圖1所示，新物體識別試驗中，與Control相比，Model組小鼠識別指數(shù)減小，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）；與Model組相比，Positive和Naringin組小鼠識別指數(shù)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）；與Naringin組相比，NG + ICI182780組小鼠識別指數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）。

圖1 柚皮苷對小鼠新物體識別指數(shù)的影響（n = 15）Fig.1 Effects of naringin on new object recognition experiment in mice（n = 15）

小鼠在前4 d訓(xùn)練中尋找平臺潛伏期時長逐漸降低，但Control組、Naringin組小鼠潛伏期下降較快。結(jié)果如圖2所示，與Control組相比，Model組小鼠定位航行實(shí)驗潛伏期增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明小鼠記憶鞏固能力較差。與Model組相比，Positive組和Naringin組小鼠潛伏期減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）；與Naringin組相比，NG + ICI182780組小鼠潛伏期減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）。NG + ICI182780組小鼠搜臺潛伏期明顯高于柚皮苷組，說明在ER阻斷劑的干預(yù)下，小鼠學(xué)習(xí)進(jìn)步緩慢。

圖2 柚皮苷對小鼠定位航行潛伏期的影響（n = 15）Fig.2 Effects of naringin on navigation latency of mice（n = 15）

空間探索試驗結(jié)果如圖3所示，與Control組相比，Model組小鼠平臺穿越次數(shù)和目標(biāo)象限停留時間減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）；與Model組相比，Positive組和Naringin組小鼠平臺穿越次數(shù)和靶象限停留時間增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與Naringin組相比，NG+ICI182780組小鼠平臺穿越次數(shù)和靶象限停留時間降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01），靶象限停留時間降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05）。

圖3 柚皮苷對小鼠空間探索試驗的影響（n = 15）Fig.3 Effects of naringin on spatial exploration of mice（n = 15）

3.2 柚皮苷對亞硝酸鈉模型小鼠海馬區(qū)及下丘腦區(qū)組織病理改變的影響

Control組小鼠的海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，數(shù)量較多，染色均一。亞硝酸鈉損傷了小鼠海馬區(qū)，表現(xiàn)為紊亂排列和縮小的神經(jīng)元細(xì)胞，由于核固縮現(xiàn)象明顯，見不到明顯的核仁；無論P(yáng)ositive組還是Naringin給藥組都在一定程度上恢復(fù)了海馬區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量，形態(tài)正常，排列規(guī)整，核仁清晰，見圖4。下丘腦的HE染色顯示亞硝酸鈉損傷了小鼠下丘腦，神經(jīng)細(xì)胞排列松散, 細(xì)胞間隙較寬，細(xì)胞核未著色，細(xì)胞核體積明顯擴(kuò)張，核仁不明顯，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，Positive組也出現(xiàn)了與Model組相類似的病理變化；Naringin給藥組神經(jīng)元細(xì)胞排列較為緊密，細(xì)胞間隙適中，細(xì)胞核深染，核仁清晰。ICI182780的干預(yù)使Naringin對海馬區(qū)和下丘腦區(qū)的神經(jīng)元的保護(hù)作用大大減弱，見圖5。

圖4 小鼠海馬體區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)（HE染色，×200）Fig.4 Neuropathological morphology of hippocampus in mice（HE staining, ×200）

圖5 小鼠下丘腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)（HE染色，×200）Fig.5 Pathological morphology of neurons in the hypothalamus of mice（HE staining, ×200）

3.3 透射電鏡觀察小鼠海馬體超微結(jié)構(gòu)

Model組和雌激素阻斷劑組神經(jīng)元鏡下細(xì)胞核出現(xiàn)固縮狀態(tài)，核膜增厚，線粒體絮狀變性，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張脫顆粒，突觸膜結(jié)構(gòu)不清晰，囊泡數(shù)量減少。Control組小鼠神經(jīng)元核膜結(jié)構(gòu)清晰，染色質(zhì)如細(xì)沙狀呈現(xiàn)，細(xì)胞核占據(jù)大部分視野，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，線粒體發(fā)達(dá)，突觸膜結(jié)構(gòu)完整，小泡數(shù)量較多。Positive組和Naringin組較相似，神經(jīng)元細(xì)胞核膜結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，線粒體發(fā)達(dá)，囊泡數(shù)量明顯增多，見圖6。

圖6 小鼠海馬體區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.6 Ultrastructure of nerve cells in hippocampus of mice

3.4 免疫組織化學(xué)觀察海馬體ER表達(dá)

與Control組相比，Model組小鼠海馬體中ERβ表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）；與Model組相比，Naringin組小鼠ERβ表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）；與Naringin組相比，NG + ICI182780組小鼠ERβ表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）。與Control組相比，Model組小鼠海馬體內(nèi)ERα表達(dá)情況減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）；與Model組相比，給藥組小鼠ERα表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）；與Naringin組相比，雌激素阻斷劑組小鼠ERα表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01），見圖7。

圖7 柚皮苷對小鼠海馬體ERβ、下丘腦ERα表達(dá)的影響（OD值）Fig.7 Effects of Naringin on the expression of ERβ in hippocampus,ERα in hypothalamus of mice（OD Value）

3.5 海馬體中 ERβ和P-P38/P38蛋白的變化

與Control組相比，Model組小鼠海馬體ERβ蛋白表達(dá)減少，P-P38/P38蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）；與Model組相比，給藥組小鼠海馬體ERβ蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）；P-P38/P38蛋白表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）；與Naringin組相比，NG +ICI182780組小鼠海馬體ERβ蛋白表達(dá)減少（P<0.01）；P-P38/P38蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01），見圖8。

圖8 柚皮苷對小鼠海馬體ERβ和P-P38/P38表達(dá)的影響（n = 3）Fig.8 Effects of naringin on the expression of ERβ and P-P38/P38 in hippocampus of mice（n = 3）

3.6 海馬體中APP和BACE1蛋白的含量變化

與Control組 相 比，Model組APP、BACE1表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）；與Model組相比，給藥組APP、BACE1表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）；與Naringin組相比，NG+ICI182780組小鼠海馬體中APP、BACE1表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01），見圖9。

圖9 柚皮苷對小鼠海馬體中APP、BACE1表達(dá)的影響（n = 3）Fig.9 Effects of Naringin on the expression of APP and BACE1 in hippocampus of mice（n = 3）

4 討論

亞硝酸鈉誘導(dǎo)的模型小鼠表現(xiàn)出認(rèn)知能力的顯著下降，與AD患者臨床表現(xiàn)出的漸進(jìn)性記憶鞏固功能障礙相類似。本研究證明了柚皮苷能夠明顯改善記憶損傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，與陽性對照藥雌二醇有類似的作用，但卻未出現(xiàn)對下丘腦明顯的損傷作用。

眾所周知，AD主要病理特征為海馬體Aβ的異常沉積。BACE1是APP生成 Aβ 所需的限速酶。柚皮苷可降低APP、BACE1的表達(dá)，降低Aβ沉積概率，減輕海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞損傷，從而減輕模型小鼠癡呆表現(xiàn)。在雌激素受體阻斷劑反向驗證下，柚皮苷的保護(hù)作用明顯減弱，說明柚皮苷對Aβ形成的有效抑制是依賴于ER的。

ERα 主要分布在下丘腦，亞硝酸鈉模型小鼠腦源性雌激素快速消耗，雌激素分泌減少的同時，ERα表達(dá)下調(diào)。柚皮苷對下丘腦的病理無明顯改變，表明柚皮苷在本文所用的劑量具有較高的選擇性，對ERα也無明顯的調(diào)節(jié)作用。ERβ 主要分布大腦皮質(zhì)、海馬體以及小腦等部位，精確參與調(diào)控與神經(jīng)元存活密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)、酶或者結(jié)構(gòu)蛋白等基因轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果表明柚皮苷可通過上調(diào)ERβ受體發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并且能通過MAPK/P38信號途徑發(fā)揮快速非基因調(diào)節(jié)效應(yīng)，從而改善神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能。

柚皮苷擁有植物雌激所具有的雜環(huán)多酚結(jié)構(gòu)，與ERβ具有較高的親和力。從本文的研究結(jié)果分析，其具有雌激素樣效應(yīng)，對下丘腦ERα影響較小，可選擇性作用于海馬體ERβ受體。而且，與雌二醇相比柚皮苷對下丘腦的抑制作用較小，長期給藥未出現(xiàn)下丘腦的明顯萎縮。這一特征使其相較于經(jīng)典雌激素（人工合成）具有一定的優(yōu)勢。本研究證明了柚皮苷能夠上調(diào)模型小鼠ERβ表達(dá)，在ICI182780的反向驗證下，同時證明了柚皮苷對P-P38/P38抑制作用是依賴于ER實(shí)現(xiàn)的。

5 結(jié)論

柚皮苷能夠上調(diào)亞硝酸鈉模型小鼠ERβ在海馬體齒狀回的表達(dá)，對下丘腦ERα影響較弱，能夠抑制P38-MAPK信號通路，減少Aβ的異常沉積，從而減輕Aβ對神經(jīng)元的毒性作用，具備被開發(fā)為抗AD藥物的潛力。