魏春陽,齊國先,王衍富，張 華，張多多

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽 110001；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科，遼寧 大連 116011；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心律失常科，遼寧 大連 116011)

血管老化是心腦血管疾病一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素，管腔擴(kuò)張和管壁增厚是血管老化最明顯的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，導(dǎo)致彈性動(dòng)脈僵硬度增加、順應(yīng)性下降，同時(shí)血管修復(fù)、新生能力降低。血管平滑肌細(xì)胞衰老是血管老化主要機(jī)制之一，老化增厚的血管主要由肥大的平滑肌及間質(zhì)構(gòu)成。腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis， TWEAK)是配體超家族的新成員之一，與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，并參與心血管重塑的幾種病理過程[1]，但TWEAK及其受體是否參與血管老化進(jìn)程，目前尚未見研究涉及。本研究通過觀察TWEAK及其受體成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)蛋白14(fibroblast growth factor-inducing protein 14，F(xiàn)n14)在血管平滑肌細(xì)胞衰老時(shí)的表達(dá)及作用，擬對(duì)TWEAK在血管老化中的作用有初步的認(rèn)識(shí)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品及試劑

大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(A10細(xì)胞,萬類生物ATCC來源，貨號(hào)CRL-1476)、細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色試劑盒(Solarbio公司)、人AngⅡ(Aladdin公司)、TWEAK過表達(dá)腺病毒及其對(duì)照(GFP熒光標(biāo)記)、TWEAK抗體(Abcam公司)、Fn14抗體(Bioss公司)、P53抗體(Abcam公司)、P21抗體(Rockland公司)。

1.2 血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)與分組

A10細(xì)胞 10%胎牛血清培養(yǎng)基，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5代。先將A10細(xì)胞分為對(duì)照組及AngⅡ組，經(jīng)無血清培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化后，對(duì)照組10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，AngⅡ組10%血清培養(yǎng)基加1×10-7mol/L的AngⅡ培養(yǎng)1、3、7 d，檢測(cè)各組細(xì)胞衰老情況。再將A10細(xì)胞分為對(duì)照組、未感染組、空載體組及TWEAK過表達(dá)組，經(jīng)無血清培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組、未感染組不做轉(zhuǎn)染，空載體組及TWEAK過表達(dá)組分別轉(zhuǎn)染空載體腺病毒及TWEAK過表達(dá)腺病毒。轉(zhuǎn)染48 h后，未感染組、空載體組及TWEAK過表達(dá)組10%血清培養(yǎng)基加1×10-7mol/L的AngⅡ培養(yǎng)，對(duì)照組10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，7 d后檢測(cè)各組細(xì)胞衰老情況。

1.3 設(shè)計(jì)并合成TWEAK過表達(dá)腺病毒及其對(duì)照載體

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中TWEAK的CDS序列以及質(zhì)粒圖譜上的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)TWEAK引物(引物由上海生工生物工程有限公司合成，見表1)。通過PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增，利用多功能DNA純化回收試劑盒(BioTeke)包裝純化PCR產(chǎn)物，得到的目的基因與pUM-T simple vector(BioTeke)連接，利用分子克隆方法擴(kuò)增TWEAK DNA并構(gòu)建腺病毒載體(GFP熒光標(biāo)記)。空質(zhì)粒包裝腺病毒作為空載體組。培養(yǎng)VSMCs細(xì)胞，進(jìn)行腺病毒轉(zhuǎn)染。

表1 引物序列表

下劃線部分是酶切位點(diǎn)

1.4 SA-β-Gal染色試劑盒檢測(cè)細(xì)胞衰老

SA-β-Gal是一種可用來鑒別細(xì)胞衰老的特異性生物標(biāo)志，細(xì)胞衰老時(shí)其活性升高，染色后胞內(nèi)產(chǎn)生藍(lán)色沉淀物即為染色陽性。按照染色試劑盒操作說明進(jìn)行細(xì)胞染色。熒光顯微鏡下觀察并拍照，每組隨機(jī)選取視野，觀察1 000個(gè)細(xì)胞，衰老的細(xì)胞染色質(zhì)表現(xiàn)為藍(lán)染，計(jì)數(shù)衰老細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.5 RT-PCR檢測(cè)TWEAK mRNA水平

根據(jù)說明使用TRIpure試劑(BioTeke)從大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中提取總RNA。通過Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(BioTeke)將所得到的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以得到對(duì)應(yīng)的cDNA。用SYBR Green(Solarbio)及ExicyclerTM96熒光定量儀(BIONEER)進(jìn)行熒光定量分析，采用 2-△△ CT方法分析數(shù)據(jù)。引物序列見表2。

表2 引物序列表

1.6 Western blot檢測(cè)TWEAK、Fn14、P53、P21蛋白表達(dá)

根據(jù)各組細(xì)胞每個(gè)樣本的質(zhì)量及體積加入相應(yīng)體積的裂解緩沖液抽提蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣本蛋白濃度。每組取40 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE(濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%、12%、10%)分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。室溫下用TBST緩沖液配制的5%(M/V)脫脂奶粉將膜封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜，所有一抗均用5%(M/V)脫脂奶粉稀釋(TWEAK 1∶1 000、Fn14 1∶1 000、P53 1∶500、P21 1∶500)。孵育一抗后的PVDF膜用TBST洗滌4次，加入5%(M/V)脫脂奶粉稀釋羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育45 min，TBST洗滌6次，ECL發(fā)光液顯色。曝光后的PVDF膜進(jìn)行抗體剝脫后(此實(shí)驗(yàn)中，指標(biāo)Fn14、P21的目的條帶與內(nèi)參條帶相差較遠(yuǎn)，故分開電泳，不做剝脫處理)，加入β-actin抗體及羊抗兔IgG-HRP，ECL發(fā)光液顯色。最后用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel-PRO Analyzer軟件)分析目的條帶的光密度值，以目的蛋白和內(nèi)參譜帶灰度值的比值示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 AngⅡ作用下血管平滑肌細(xì)胞衰老情況

AngⅡ作用1 d、3 d和7 d后，SA-β-Gal 染色結(jié)果顯示，隨著作用時(shí)間延長，AngⅡ組 SA-β-Gal 染色陽性率增多，分別達(dá)到細(xì)胞總數(shù)目的(11.52±2.1)%、(32.30±5.25)%、(64.50±7.32)%，明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著作用時(shí)間延長，AngⅡ組P53、P21蛋白表達(dá)均明顯升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

AngⅡ作用1 d后便可見平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)SA-β-Gal染色(藍(lán)色)，作用3 d、7 d后SA-β-Gal染色陽性率逐漸增多，而對(duì)照組幾乎無SA-β-Gal染色；*與對(duì)照組比較，P<0.05；比例尺：50 μm圖1 AngⅡ不同作用時(shí)間SA-β-Gal染色Fig.1 SA-β-Gal staining with different time length

2.2 TWEAK及Fn14在AngⅡ誘導(dǎo)衰老血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)情況

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，AngⅡ分別作用1 d、3 d、7 d后，AngⅡ組TWEAK、Fn14蛋白表達(dá)均明顯升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著AngⅡ作用時(shí)間延長，AngⅡ組TWEAK、Fn14表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加，對(duì)1 d、3 d、7 d時(shí)TWEAK、Fn14分別進(jìn)行組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.3 TWEAK過表達(dá)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞衰老的影響

TWEAK過表達(dá)腺病毒感染血管平滑肌細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡顯示轉(zhuǎn)染成功(圖4)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)顯示TWEAK過表達(dá)組TWEAK mRNA及蛋白表達(dá)明顯增多，與對(duì)照組及空載體對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5、圖6A。未感染組、空載體組、TWEAK過表達(dá)組分別加入1×10-7mol/L的AngⅡ作用7 d后，Western blot檢測(cè)顯示TWEAK過表達(dá)組細(xì)胞在發(fā)生應(yīng)激衰老過程中，F(xiàn)n14及P53、P21蛋白表達(dá)明顯增多，與對(duì)照組、未感染組、空載體組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖6B、C、D。

A：Western blot檢測(cè)P53蛋白表達(dá)水平；B：Western blot檢測(cè)P21蛋白表達(dá)水平；A1、A2、A3：對(duì)照組培養(yǎng)1、3、7 d；B1、B2、B3： AngⅡ組分別處理1、3、7 d。*與對(duì)照組比較，P<0.05圖2 AngⅡ處理1、3、7 d后P53、P21蛋白表達(dá)的變化Fig.2 Expression of P53，P21 in VSMCs under AngⅡ administration

A：Western blot檢測(cè)TWEAK蛋白表達(dá)水平；B：Western blot檢測(cè)Fn14蛋白表達(dá)水平；A1、A2、A3：對(duì)照組培養(yǎng)1、3、7 d；B1、B2、B3： AngⅡ組分別處理1、3、7 d。*與對(duì)照組比較，P<0.05；#不同時(shí)間分組間比較，P<0.05圖3 AngⅡ處理1、3、7 d后TWEAK、Fn14蛋白表達(dá)的變化Fig.3 Expression of TWEAK，F(xiàn)n14 in VSMCs under AngⅡ administration

圖4 腺病毒載體感染血管平滑肌細(xì)胞48 h后熒光照片(×200)Fig.4 GFP fluorescence photos of VSMCs transfected by adenoviral vectors 48 h after transfection(×200)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TWEAK mRNA表達(dá)平均相對(duì)含量，*與對(duì)照組、空載體組比較，P<0.05圖5 TWEAK mRNA表達(dá)的變化Fig.5 Expression of TWEAK mRNA

3 討 論

衰老是心腦血管疾病最不可忽視的危險(xiǎn)因素，在人體衰老過程中血管老化表現(xiàn)得尤為突出，可導(dǎo)致血管壁增厚、血管彈性下降、管壁鈣質(zhì)增加、內(nèi)皮功能減退，促進(jìn)血管粥樣硬化病變，造成心腦血管疾病發(fā)生率明顯升高。血管平滑肌細(xì)胞是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)及維持血管張力的主要細(xì)胞成分，在血管老化中起著非常重要的作用。衰老的血管平滑肌細(xì)胞具有較低的增殖潛力和更高的活性氧(ROS)水平，并且與氧化應(yīng)激所引起的損傷增加相關(guān)[2]，而ROS和核DNA損傷都是過早衰老的重要誘因[3]。血管平滑肌細(xì)胞還通過調(diào)節(jié)不同成骨細(xì)胞基因在進(jìn)行復(fù)制性衰老時(shí)表達(dá)“骨細(xì)胞樣”表型，增強(qiáng)其鈣化的易感性[4]，進(jìn)而導(dǎo)致血管壁鈣質(zhì)沉積。TWEAK是配體超家族的成員之一，F(xiàn)n14是其最主要功能受體[1]。TWEAK與腫瘤樣壞死因子(TNF)家族其他成員一樣，具有激活炎癥反應(yīng)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、血管生成和鈣化等作用。近年來一些研究顯示，TWEAK/Fn14與動(dòng)脈硬化、胰和腎臟疾病、心力衰竭、腹部主動(dòng)脈瘤等疾病密切相關(guān)[5]。TWEAK可通過核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)活化途徑促進(jìn)無機(jī)磷酸鹽誘導(dǎo)的血管平滑肌成骨樣轉(zhuǎn)化[6]，誘導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)引起血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移[7]。另外也有研究顯示，在老年小鼠骨骼肌中Fn14表達(dá)明顯增多，TWEAK/Fn14促進(jìn)年齡相關(guān)的骨骼肌萎縮與纖維化[8]。但TWEAK及其受體是否促進(jìn)血管平滑肌衰老，參與血管老化進(jìn)程，目前尚無研究涉及。

A：Western blot檢測(cè)腺病毒感染48 h后TWEAK蛋白表達(dá)水平，*與對(duì)照組、空載體組比較，P<0.05；B：Western blot檢測(cè)Fn14蛋白表達(dá)水平，AngⅡ誘導(dǎo)衰老7 d后，*與對(duì)照組、未感染組、空載體組比較，P<0.05；C：Western blot檢測(cè)P53蛋白表達(dá)水平，AngⅡ誘導(dǎo)衰老7 d后，*與對(duì)照組、未感染組、空載體組比較，P<0.05；D：Western blot檢測(cè)P21蛋白表達(dá)水平，AngⅡ誘導(dǎo)衰老7 d后，*與對(duì)照組、未感染組、空載體組比較，P<0.05圖6 TWEAK及Fn14、P53、P21蛋白表達(dá)的變化Fig.6 Expression of TWEAK，P53，P21

血管平滑肌細(xì)胞的衰老表現(xiàn)符合細(xì)胞衰老的通常特點(diǎn)，如抑癌基因P16和或P21的上調(diào)、細(xì)胞和核肥大、SA-β-Gal積累等[9]。無論是端粒依賴性復(fù)制性衰老還是氧化應(yīng)激、DNA損傷、癌基因激活等所致應(yīng)激誘導(dǎo)性衰老，都受P53-P21和P16這兩個(gè)經(jīng)典通路調(diào)控，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制蛋白pRb活化，使轉(zhuǎn)錄因子E2F的失活，從而抑制細(xì)胞增殖。AngⅡ 可使細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激誘導(dǎo)性衰老[10]，被廣泛使用于體內(nèi)外血管衰老研究中，AngⅡ 誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞衰老模型有效且可重復(fù)[11]。本研究利用AngⅡ 處理大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，隨著AngⅡ 作用時(shí)間的延長，血管平滑肌細(xì)胞SA-β-Gal染色增多，P53、P21表達(dá)增多，表明血管平滑肌細(xì)胞在AngⅡ 作用下出現(xiàn)應(yīng)激誘導(dǎo)性衰老。與此同時(shí)，與對(duì)照組比較，TWEAK及Fn14在衰老的血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)逐漸增多，提示血管平滑肌細(xì)胞衰老與TWEAK及Fn14關(guān)系密切。

為了進(jìn)一步明確TWEAK對(duì)血管平滑肌細(xì)胞衰老的意義，我們?cè)O(shè)計(jì)合成TWEAK過表達(dá)腺病毒并成功轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激誘導(dǎo)性衰老時(shí)，與對(duì)照組、未感染組及空載體組比較，TWEAK過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染組Fn14、P53、P21表達(dá)明顯增多，表明TWEAK可上調(diào)Fn14，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞衰老過程具有促進(jìn)作用。已有研究顯示，TWEAK與Fn14結(jié)合，可以激活NF-κB信號(hào)通路[12]，NF-κB是與衰老密切相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，抑制NF-κB信號(hào)通路有助于延緩衰老及衰老相關(guān)性疾病[13]，NF-κB在調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老方案方面起著核心作用[14]。據(jù)此我們推測(cè)TWEAK/Fn14可能通過激活NF-κB信號(hào)系統(tǒng)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞衰老，這有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

盡管本研究發(fā)現(xiàn)TWEAK可上調(diào)衰老細(xì)胞Fn14，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞衰老，但TWEAK/Fn14具體作用環(huán)節(jié)有待于更深入的研究，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討對(duì)血管老化進(jìn)程中的重要靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，或可為臨床上防治細(xì)胞衰老相關(guān)心血管疾病提供一個(gè)可利用的策略。