張偉寧，周陽(yáng)揚(yáng)，胡爽，劉艷楊，何澤云

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是以高蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和不同程度的水腫為主要表現(xiàn)的臨床綜合征［1］。蛋白尿是NS患者的初始病因，是其進(jìn)展為慢性腎功能不全的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［2］。因此，降低尿蛋白是NS患者治療的目標(biāo)之一。

中醫(yī)學(xué)無(wú)NS的記載，根據(jù)其癥狀，在疾病的不同階段可歸屬為“水腫”“虛勞”“尿濁”等范疇。禾腎丸是何澤云教授根據(jù)蛋白尿?qū)倨⒛I虧虛、精微下泄的基本病機(jī)，由清代名方金鎖固精丸加減化裁而來(lái)，蓮子易蓮須取其健脾固腎之功，加山藥取治虛勞之薯蕷丸意，通補(bǔ)肺脾腎三焦，加大棗顧護(hù)中焦胃氣，稍佐黃柏瀉相火、清濕熱，使全方補(bǔ)而不滯。其由沙苑子、山藥、牡蠣（醋炙）、龍骨（醋炙）、蓮子、芡實(shí)、大棗、黃柏組成，是何澤云教授臨證30余年治療各種腎小球性蛋白尿的經(jīng)驗(yàn)方。前期臨床研究證明，禾腎丸可減少24 h尿蛋白量，升高血漿白蛋白，糾正脂代謝紊亂，改善NS患者臨床癥狀［3－6］。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，禾腎丸能減少大鼠24 h尿蛋白排泄，保護(hù)受損的足細(xì)胞，減輕腎組織纖維化［7－10］?？梢?jiàn)，禾腎丸可明顯降低蛋白尿，延緩病情，但其作用機(jī)制仍未完全清楚。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究禾腎丸治療NS蛋白尿的藥理機(jī)制和分子作用靶點(diǎn)，旨在深入探討禾腎丸減輕NS蛋白尿的作用機(jī)理，為其臨床及科研提供更充分的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 禾腎丸化學(xué)成分研究使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP，http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）［11］和BATMAN－TCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／bionet.ncpsb.org／batman－tcm／）［12］，分別以“沙苑子（SHA YUAN ZI）”“山藥（SHAN YAO）”“牡蠣（MU LI）”“龍骨（LONG GU）”“蓮子（LIAN ZI）”“芡實(shí)（QIAN SHI）”“大棗（DA ZAO）”和“黃柏（HUANG BAI）”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取其主要化學(xué)成分。

1.2 禾腎丸活性化合物篩選及靶點(diǎn)研究口服利用度（oral availability，OB）是藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的重要參數(shù)之一；類(lèi)藥性（druglikeness，DL）表示與已知化合藥相比成分的相似性。中藥相關(guān)化合物是否具備較高的活性取決于OB值和DL值，值越高，表明中藥相關(guān)化合物具備更高的活性［13－14］。本研究通過(guò)查閱現(xiàn)有相關(guān)研究文獻(xiàn)，選取OB≥30%、DL≥0.18作為活性化合物的篩選閥值，獲取相關(guān)活性化合物的靶點(diǎn)蛋白。

1.3 NS和蛋白尿靶點(diǎn)研究通過(guò)Genecards（https：／／www.genecards.org／）、TTD（http：／／db.idrblab.net／ttd／）、OMIM（https：／／omim.org／）、Drugbank（https：／／www.drugbank.ca／）、Digsee（http：／／210.107.182.61／geneSearch／）等疾病數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與NS和蛋白尿相關(guān)的基因。以“nephrotic syndrome”和“proteinuria”為關(guān)鍵詞在上述疾病數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，下載或?qū)С雠cNS和蛋白尿有關(guān)的全部基因。

1.4 靶點(diǎn)蛋白基因名標(biāo)準(zhǔn)化及禾腎丸治病靶點(diǎn)研究為了便于后續(xù)分析及確定靶點(diǎn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)化簡(jiǎn)寫(xiě)，使用PubMed（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／pubmed）和UniProt（https：／／www.uniprot.org）對(duì)禾腎丸活性化合物靶點(diǎn)、NS靶點(diǎn)和蛋白尿靶點(diǎn)進(jìn)行校正及標(biāo)準(zhǔn)化。通過(guò)Venn 2.1（https：／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／）將標(biāo)準(zhǔn)化的禾腎丸活性化合物靶點(diǎn)、NS靶點(diǎn)和蛋白尿靶點(diǎn)進(jìn)行整合，取交集得到三者共同靶點(diǎn)（簡(jiǎn)稱(chēng)禾腎丸治病靶點(diǎn)）。

1.5 禾腎丸－活性化合物－治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建為了解禾腎丸中單味中藥的活性化合物和治病靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，本研究采用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建禾腎丸－活性化合物－治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 蛋白質(zhì)相互作用（protein－protein interaction network，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／string－db.org／），設(shè)置條件“minimum required interaction score＝0.9”和“hide disconnected nodes in the network”，并運(yùn)用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建禾腎丸治病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖。探究禾腎丸治療NS蛋白尿的主要作用靶點(diǎn)。

1.7 GO富集和KEGG通路富集分析為探究禾腎丸治療NS蛋白尿在生物學(xué)角度的科學(xué)內(nèi)涵，本研究將“1.6”中靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入David v 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／david.ncifcrf.gov／），限定物種和背景均為“Homo sapiens”。

2 結(jié)果

2.1 禾腎丸候選化合物的篩選通過(guò)TCMSP和Batman－TCM數(shù)據(jù)庫(kù)收集禾腎丸中藥物的化學(xué)成分，分別為沙苑子8個(gè)、山藥12個(gè)、牡蠣4個(gè)、龍骨2個(gè)、蓮子4個(gè)、芡實(shí)1個(gè)、大棗18個(gè)、黃柏44個(gè)，共74個(gè)活性化合物。

2.2 禾腎丸活性化合物、NS、蛋白尿靶點(diǎn)和禾腎丸治病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果經(jīng)過(guò)PubMed和Uniprot校正所有靶點(diǎn)名稱(chēng)，沙苑子、山藥、牡蠣、龍骨、蓮子、芡實(shí)、大棗和黃柏潛在靶點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為166、59、334、472、35、21、179、92（不包含重復(fù)靶點(diǎn)）。應(yīng)用Genecards、TTD、OMIM（https：／／omim.org／）、Drugbank、Digsee等疾病數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索并整合，分別得到NS和蛋白尿靶點(diǎn)基因分別為1 179個(gè)和3 354個(gè)。用Venn 2.1軟件將禾腎丸活性化學(xué)成分靶點(diǎn)與NS作用靶點(diǎn)及蛋白尿作用靶點(diǎn)進(jìn)行整合，得到禾腎丸治病靶點(diǎn)共112個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 禾腎丸治病靶點(diǎn)

2.3 禾腎丸－活性化合物－治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建通過(guò)Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建禾腎丸－活性化合物－治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)由191個(gè)節(jié)點(diǎn)和538條邊組成，其中紅色代表單味中藥（8個(gè)），深藍(lán)色代表活性化合物（74個(gè)），藍(lán)色代表治病靶點(diǎn)（112個(gè)），見(jiàn)圖2。

圖2 禾腎丸－活性化合物－治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 禾腎丸治病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)將112個(gè)禾腎丸治病靶點(diǎn)蛋白輸入STRING（https：／／string－db.org／）數(shù)據(jù)庫(kù)，得出97個(gè)靶點(diǎn)蛋白，見(jiàn)圖3。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)指標(biāo)度值繪制出排名前30位的相關(guān)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的條形圖，見(jiàn)圖4。

圖3 禾腎丸治病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 禾腎丸治病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)條形圖（前30位）

2.5 GO富集與KEGG通路富集分析對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的97個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO富集分析，設(shè)定P＜0.05。禾腎丸治病靶點(diǎn)在生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）主要富集在藥物反應(yīng)、細(xì)胞外空間蛋白質(zhì)結(jié)合等方面。結(jié)果表明，禾腎丸治病靶點(diǎn)可能通過(guò)上述不同的過(guò)程參與了NS的病理和生理過(guò)程，見(jiàn)圖5。對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的97個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG通路分析，設(shè)定P＜0.05，并去掉無(wú)關(guān)通路，如錐蟲(chóng)病、乙肝、HTLV－I感染等，見(jiàn)圖6。禾腎丸治病靶點(diǎn)主要參與PI3K－Akt信號(hào)通路、MAKP信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等，表明禾腎丸可能介導(dǎo)上述通路發(fā)揮治療NS作用。

圖5 禾腎丸治病靶點(diǎn)GO富集結(jié)果可視化（BP、CC、MF僅列出前10位）

圖6 禾腎丸治病靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，NS的發(fā)病機(jī)制與素體不足，脾腎虧虛，肺衛(wèi)不固，復(fù)感風(fēng)、濕、瘡毒之邪有關(guān)。風(fēng)濕相搏、衛(wèi)氣郁閉、肺失通調(diào)、脾氣不足、傳輸統(tǒng)攝不利、腎氣虛怯、封藏開(kāi)闔無(wú)權(quán)、則水濕泛溢，精微下泄，發(fā)為水腫、蛋白尿。何澤云教授認(rèn)為，蛋白尿?qū)偃梭w的精微物質(zhì)，為脾氣所統(tǒng)攝，腎氣所封藏，若脾腎虧虛，則統(tǒng)攝、封藏?zé)o力，發(fā)為蛋白尿，故蛋白尿形成的核心病機(jī)是脾腎虧虛，而健脾益腎固精則是蛋白尿的根本治法。

禾腎丸中沙苑子甘、溫，具有補(bǔ)腎助陽(yáng)、固精縮尿之功，山藥甘、平，可通補(bǔ)肺、脾、腎，又兼澀性，二者共為君藥；龍骨甘、澀、平，有收斂固澀之功，牡蠣咸、微寒，功同龍骨，二者為常用藥對(duì)，共具固腎澀精之功；芡實(shí)甘、澀、平，偏于補(bǔ)腎，有健脾化濕、固腎澀精之功，蓮子甘、澀、平，偏于補(bǔ)脾，亦有健脾止瀉、益腎澀精，二者相須為用，共具健脾化濕、補(bǔ)腎澀精之功，其四者共為臣藥；黃柏苦、寒，善瀉相火、清濕熱，為佐藥，與君臣藥配伍，使其補(bǔ)而不滯，且可防相火、濕熱下擾腎精所致精微下泄；大棗甘、溫，具有健脾益氣養(yǎng)血之功，為使藥，脾胃之氣充足則受納運(yùn)化強(qiáng)健，則統(tǒng)攝精微之力增強(qiáng)。全方以健脾益腎固精為主，祛濕清熱為輔，既可固腎精、補(bǔ)脾氣，又可瀉相火、清濕熱、補(bǔ)中有瀉、補(bǔ)而不滯，對(duì)NS屬脾腎虧虛，精微不固，尿蛋白久久不消者療效顯著。

由“禾腎丸－活性化合物－治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖”可知，從化合物角度，度值排名前5的化合物分別為quercetin－大棗、沙苑子（槲皮素），aluminum－牡蠣，beta－carotene－大棗、芡實(shí)（β－胡蘿卜素），beta－sitosterol－大棗、沙苑子（β－谷甾醇），kaempferol－沙苑子（山柰酚）。藥理研究表明，槲皮素主要存在于大棗和沙苑子中［15－16］；牡蠣中含有鎂、鐵、硅、鋁等多種人體必需的微量元素［17］；β－胡蘿卜素是大棗和芡實(shí)的活性成分［18－19］；β－谷甾醇是大棗和沙苑子的已知活性成分［20－21］；山奈酚是沙苑子主要成分［16］，兩者結(jié)果相符，表明上述化合物可能是禾腎丸發(fā)揮治療NS的主要活性成分。此外，在排名前5的化合物中，沙苑子和大棗對(duì)應(yīng)化合物最多，其次是牡蠣和芡實(shí)，該結(jié)果與禾腎丸“君臣佐使”大致相符。然而，大棗為使藥，該結(jié)果可能與不同單味中藥所含的成分含量不同有關(guān)。

從靶點(diǎn)角度，度值排名前5的分別是PTGS2、PTGS1、ADRB1、LYZ、RXRA。PTGS2、PTGS1與腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng)有關(guān)［22］，PTGS2（即COX－2）在腎臟中主要表達(dá)于致密斑。發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，COX－2表達(dá)急劇升高。研究表明，COX－2在大鼠及人類(lèi)腎小球損傷中表達(dá)均上調(diào)，選擇性COX－2抑制劑可減輕腎小球炎癥，減輕足細(xì)胞損傷及凋亡，減少尿蛋白漏出［23－28］。既往認(rèn)為，PTGS1（即COX－1）主要維持正常的生理功能。但近年來(lái)的研究表明，COX－1與多種炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［29］，COX－1可能抑制腎小球腎炎大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白－1（MCP－1）的產(chǎn)生，減輕腎小球內(nèi)單核細(xì)胞浸潤(rùn)，緩解腎小球的炎癥［30］。故推測(cè)禾腎丸可能通過(guò)抑制COX－2及促進(jìn)COX－1基因或蛋白表達(dá)，減少NS患者尿蛋白。

PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果表明，白細(xì)胞介素（interleukin－6，IL－6）、Akt1、JUN等可能是禾腎丸治療NS的重要靶點(diǎn)群。其中IL－6的度值最大，表明其在禾腎丸治病靶點(diǎn)群中可能占據(jù)主要地位。IL－6是一種可介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮表達(dá)黏附分子，導(dǎo)致大量的炎癥細(xì)胞在腎組織中黏附、聚集。研究表明，血漿高水平的IL－6可促進(jìn)腎小球血管內(nèi)皮表面的糖蛋白脫落［31］，導(dǎo)致腎小球毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)。此外，IL－6可促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)的生成，這些因素導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)功能受損，蛋白尿漏出。研究表明，NS患者血清IL－6水平明顯升高，且疾病緩解后又明顯下降［32－34］。表明禾腎丸可能通過(guò)降低IL－6的含量，緩解NS患者腎小球炎癥狀態(tài)，抑制系膜細(xì)胞增生，緩解病情，該結(jié)果與禾腎丸－活性化合物－治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中PTGS2、PTGS1、ADRB1等炎性靶點(diǎn)處于核心地位的一致，表明禾腎丸在調(diào)節(jié)NS患者炎癥方面發(fā)揮重要作用，有待進(jìn)一步研究。

GO富集分析結(jié)果顯示，禾腎丸治病靶點(diǎn)在BP、CC、MF主要涉及藥物反應(yīng)、細(xì)胞外空間蛋白質(zhì)結(jié)合等方面，表明禾腎丸治病靶點(diǎn)的多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)、長(zhǎng)期適應(yīng)性調(diào)節(jié)是治療NS可能作用機(jī)制。KEGG通路結(jié)果表明，禾腎丸治病靶點(diǎn)涉及通路包括：PI3K－Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等，表明禾腎丸可能通過(guò)上述通路發(fā)揮治療作用。PI3K是一種脂類(lèi)第二信使，與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，其可激活A(yù)KT發(fā)揮下游生理效應(yīng)［35］。研究表明，激活PI3K／Akt信號(hào)通路是減少腎小球足細(xì)胞凋亡、維持足細(xì)胞形態(tài)和功能完整性的重要途徑［36－37］。類(lèi)似的研究也表明，在慢性腎臟病進(jìn)程中，激活A(yù)kt2有保護(hù)足細(xì)胞的作用［38］?；诖耍茰y(cè)禾腎丸可能通過(guò)激活PI3K－Akt及其下游通路的表達(dá)，而發(fā)揮對(duì)NS治療的藥理學(xué)作用。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)禾腎丸治療NS的作用機(jī)制進(jìn)行初步理論探討，結(jié)果表明，禾腎丸的主要潛在活性成分及作用靶基因與NS作用通路相關(guān)，為深入研究其作用機(jī)制提供了新思路。但由于當(dāng)前數(shù)據(jù)庫(kù)信息有限，且并非實(shí)驗(yàn)結(jié)果，缺乏實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持，存在一定的差異性和局限性，但其預(yù)測(cè)結(jié)果可作為今后研究的方向之一，有待進(jìn)一步的深入實(shí)驗(yàn)探討。