張淑紅

（唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000）

ABC 轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporter）是在生物界廣泛存在的、能夠催化腺苷三磷酸（ATP）水解并利用水解所產(chǎn)生的能量促使底物實現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運的一類膜整合蛋白。目前研究發(fā)現(xiàn)的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白已經(jīng)超過了100 種，它們廣泛存在于各類細(xì)胞器，并被證實在多個領(lǐng)域中均發(fā)揮著重要作用[1-3]。在致病真菌中，多向耐藥性ABC轉(zhuǎn)運蛋白（multidrug resistance protein，MDR）是近年來越來越多的抗真菌藥物治療效果明顯下降的最主要原因[4]。

Mlt1 蛋白是ABC 轉(zhuǎn)運蛋白超級家族成員，通過對白色念珠菌（Candida albicans）Mlt1 突變體的轉(zhuǎn)錄譜分析，發(fā)現(xiàn)參與內(nèi)吞作用、氧化還原酶活性、毒力和菌絲發(fā)育的基因被下調(diào)[5]。在植物病原真菌中Mlt1 是細(xì)胞壁完整性（CWI-MAPK）信號通路的起始蛋白[6]。CWI-MAPK 信號通路是植物病原真菌中普遍存在的一條保守通路，在生長、發(fā)育、繁殖和對逆境脅迫的感受和調(diào)節(jié)中均具有重要作用。玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）是玉米生產(chǎn)過程中重要的葉部病原真菌，引起的玉米大斑病嚴(yán)重年份可造成減產(chǎn)50%以上[7]。本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)分析玉米大斑病菌Mlt1 同源蛋白StMlt1 的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能，旨在為進一步研究StMlt1 在玉米大斑病生長和致病過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 實驗方法

利用酵母Mlt1 蛋白的氨基酸序列對玉米大斑病菌基因組（https://genome.jgi.doe.gov/portal/）進行Blastp 比對分析，獲得玉米大斑病菌Mlt1 同源蛋白StMlt1 的氨基酸序列。利用在線軟件ExPASy-ProtParam 進行一級結(jié)構(gòu)分析；利用在線軟件Predict Protein 和NPS@SOPMA 進行二級結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位分析；利用在線軟件SWISS-MODEL和PROCHECK 進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測和驗證；通過JGI 數(shù)據(jù)庫的GO 進行功能預(yù)測；利用在線軟件uniprot 獲得多個植物病原真菌Mlt1 同源蛋白的氨基酸序列；利用軟件MEGA7.0 鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[8-9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米大斑病菌Mlt1 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

StMlt1 蛋白含有1 543 個氨基酸殘基，不穩(wěn)定系數(shù)小于40，屬于穩(wěn)定蛋白；疏水性為0.021，屬于疏水性蛋白；等電點為8.55，屬于堿性蛋白質(zhì)。二級結(jié)構(gòu)元件主要包括α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，其中α-螺旋含量最高，達(dá)到54.70%。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果見圖1，其中區(qū)域L 為低復(fù)雜度區(qū)域，區(qū)域T 為跨膜螺旋區(qū)域。結(jié)構(gòu)域AAA 包含了一個ATP 酶，AAA-ATP 酶與多種細(xì)胞活動相關(guān)，參與膜融合、蛋白水解和DNA 復(fù)制等細(xì)胞過程。

圖1 StMlt1 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

經(jīng)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，得到9 個StMlt1 蛋白模型，選取可信度最高的3 個模型進行在線驗證，結(jié)果顯示模型1（可信度為95%）和模型3（可信度為83%）可驗證通過，如圖2 所示。

圖2 StMlt1 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測（左：模型1；右：模型3）

2.2 玉米大斑病菌Mlt1 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，StMlt1 蛋白定位于液泡膜（如圖3 所示），不含核定位信號。

圖3 StMlt1 蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測

2.3 玉米大斑病菌Mlt1 蛋白功能預(yù)測

GO 功能預(yù)測結(jié)果表明，StMlt1 的分子功能表現(xiàn)為ATP 酶活性與物質(zhì)跨膜運動的耦合、ATP 酶活性和ATP 連接；在生物過程方面行使轉(zhuǎn)運功能；在細(xì)胞成分方面作為膜成分。

2.4 StMlt1 蛋白的保守性和系統(tǒng)進化發(fā)育樹分析

玉米大斑病菌23 號小種菌株et28a 和1 號小種菌株ny001 的StMlt1 蛋白的氨基酸序列僅相差1 個氨基酸，說明StMlt1 在菌株間非常保守。在氨基酸序列1 535 位置處，菌株et28a 的Ala 代替ny001 的Ser，該位置不處于保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)，與跨膜和ATP 酶功能無關(guān)。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖4 所示。玉米大斑病菌StMlt1 蛋白與小麥黃斑病菌（Pyrenophora teres）和大麥網(wǎng)斑病菌（Pyrenophora tritici-repentis）的Mlt1 同源蛋白遺傳關(guān)系最近。

圖4 StMlt1 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討論

典型的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白一般包括4 個核心結(jié)構(gòu)域：兩個具有多個α-螺旋的疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD），兩個嵌于細(xì)胞膜但突出于細(xì)胞質(zhì)的催化ATP 水解的親水核苷酸結(jié)合域（NBD）[10]。大多數(shù)的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白能夠借助水解ATP 釋放的能量實現(xiàn)對各類物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運，從而調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的一系列生理活動[11]。在真菌基因組中存在著許多編碼ABC 蛋白的基因，每種ABC 家族的成員都有不同的生理角色。白色假絲酵母、新型隱球酵母、煙曲霉等致病真菌中，多向耐藥性ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的研究已經(jīng)取得重要進展[4]。研究顯示，白色念珠菌的ABC 轉(zhuǎn)運體Mlt1 定位于液泡膜，能特異地將磷脂酰膽堿（PC）轉(zhuǎn)運到空泡腔內(nèi)。Mlt1蛋白的水平會影響脂質(zhì)的同質(zhì)性，導(dǎo)致過多的生理紊亂[5]。目前關(guān)于植物病原真菌Mlt1 蛋白的研究還未見報道，本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測玉米大斑病菌Mlt1 的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能及進化關(guān)系，對于研究該蛋白在玉米大斑病致病方面的作用有著重要意義。