王琪瑋,張敬東

(遼寧省腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科二病區(qū),遼寧 沈陽 110042)

結(jié)直腸癌的發(fā)病率居我國惡性腫瘤的第2位,死亡率居第5位[1]。以西妥昔單抗為代表的抗細(xì)胞生長因子受體(EGFR)單抗,被廣泛用于KRAS基因野生型轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(mCRC)病人的轉(zhuǎn)化[2-5]及姑息治療中[6-7]。然而,西妥昔單抗與化療聯(lián)合的客觀有效率僅為55%～65%,中位無進(jìn)展生存期為10～11月,這意味著有近半數(shù)的病人未能獲益,并且有效的病人多在1年內(nèi)出現(xiàn)進(jìn)展[6,8]。因此,探討西妥昔單抗的原發(fā)及繼發(fā)耐藥機(jī)制并嘗試進(jìn)行逆轉(zhuǎn)具有重要的基礎(chǔ)及臨床意義。除了研究較充分的耐藥機(jī)制,如KRAS、NRAS、BRAF、PI3 K等基因突變導(dǎo)致下游通路的持續(xù)激活[9],近年來的研究顯示,結(jié)直腸癌中EPHA2的過表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移和更差的預(yù)后相關(guān),且可能與西妥昔單抗的療效相關(guān)[10-14]。EPHA2是促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體(EPH)家族的成員之一,目前關(guān)于EPHA2靶向治療能否逆轉(zhuǎn)西妥昔單抗的耐藥尚無深入研究。本研究旨在明確CRC 病人西妥昔單抗治療前后EPHA2的表達(dá)水平,并在原發(fā)及繼發(fā)CRC 耐藥細(xì)胞系中探索EPHA2抗體能否逆轉(zhuǎn)西妥昔單抗的耐藥。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1抗體與試劑 BCA 蛋白濃度檢測試劑盒(由美國Thermo Fisher Scientific公司提供);β-actin抗體、EPHA2抗體、p EPHA2抗體(美國Sigma公司);RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclon公司);胎牛血清(BI公司);胰蛋白酶(杭州四季青生物工程材料有限公司);MTT 試劑(美國Sigma公司);山羊抗兔二抗(美國Abcam 公司),DS-8895a(日本Daiichi Sankyo公司)。

1.1.2細(xì)胞系 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫,人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HKH-2由日本國際醫(yī)學(xué)中心研究所的SHIRASAWA 博士轉(zhuǎn)贈。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 使用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基分別對HKH-2 和HCT116細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),每2～3 d傳代1次,于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)時取對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞活性檢測 細(xì)胞用不同藥物處理72 h后,用MTT 方法檢測細(xì)胞活性。酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在450 nm 波長處的吸光度值,根據(jù)吸光度值計算不同藥物濃度對應(yīng)的細(xì)胞活性,繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.3Western blot檢測蛋白表達(dá) 細(xì)胞用不同藥物處理24 h后,收取細(xì)胞,加入胰蛋白酶和磷酸酶抑制劑,加入CytoBuster蛋白提取試劑提取總蛋白后,用BCA 法測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品于含體積分?jǐn)?shù)0.10的SDS-PAGE 中電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,加入一抗4℃搖床上過夜,加入二抗室溫孵育1 h,ECL 法顯色。在凝膠成像系統(tǒng)中成像拍照,以β-actin標(biāo)定。

1.2.4免疫組化檢測 選取2017年7月—2017年12月在遼寧省腫瘤醫(yī)院行轉(zhuǎn)化治療(西妥昔單抗聯(lián)合化療)后出現(xiàn)疾病進(jìn)展的8例結(jié)直腸癌病人,年齡43～65歲,8例病人在轉(zhuǎn)化治療前經(jīng)腸鏡活檢病理確診為結(jié)直腸腺癌,在疾病進(jìn)展后均接受姑息性手術(shù)治療,術(shù)后病理均診斷為結(jié)直腸腺癌。本研究選取該8例病人在轉(zhuǎn)化治療前的腸鏡活檢標(biāo)本蠟塊,以及轉(zhuǎn)化治療后的結(jié)直腸癌原發(fā)灶手術(shù)標(biāo)本蠟塊,標(biāo)本的組織蠟塊均保存于我院病理科。使用切片機(jī)對石蠟包埋的腫瘤組織進(jìn)行切片,厚度4～5μm,置于60 ℃恒溫干燥箱中烘烤4 h。切片脫蠟水化,之后于體積分?jǐn)?shù)0.03 H2O2中室溫?fù)u床孵育10 min,PBS清洗3次。將其放入含有EDTA 抗原修復(fù)液的鍋中,煮沸、冷卻并清洗。使用50 g/L的BSA 抗原封閉1 h,滴加一抗后于濕盒中4℃孵育過夜。復(fù)溫后二抗孵育1 h,以DAB 顯色、蘇木精復(fù)染,鹽酸乙醇分化、梯度脫水及封片,風(fēng)干后保存。免疫組化結(jié)果判定由病理科醫(yī)生按照如下標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立進(jìn)行。染色強(qiáng)度被分為4級:未著色評分為0,著色較弱評分為1分,染色中等和高強(qiáng)度分別評分為2分和3分。染色強(qiáng)度乘以染色細(xì)胞的百分比(1%～100%)獲得H-score,H-score范圍為0～300。見圖1A。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料數(shù)據(jù)以表示,兩組均數(shù)間比較使用配對t檢驗(yàn),多組均數(shù)間比較使用雙因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中西妥昔單抗耐藥后EPHA2表達(dá)上調(diào)

本研究收集了8例KRAS野生型結(jié)直腸癌病人在西妥昔單抗治療前及疾病進(jìn)展后的配對的腫瘤組織石蠟標(biāo)本,使用免疫組化方法檢測了EPHA2的表達(dá)水平,以免疫組化評分表示EPHA2表達(dá)水平。見圖1A。結(jié)果顯示,在西妥昔單抗耐藥后的結(jié)直腸癌組織中,存在EPHA2表達(dá)的明顯上調(diào)(t=6.056,P＜0.05),EPHA2 上調(diào)可能與西妥昔單抗的繼發(fā)耐藥相關(guān)。見圖1B、C。

圖1 結(jié)直腸癌病人腫瘤組織中西妥昔單抗治療前后EPHA2表達(dá)

2.2 西妥昔單抗對3種不同CRC細(xì)胞的增殖活力和EPHA2及pEPHA2表達(dá)影響

本研究前期選用KRAS野生型(KRAS-WT)的西妥昔單抗敏感CRC 細(xì)胞系HKH-2,給予遞增濃度的西妥昔單抗處理并多次傳代5個月后,已成功構(gòu)建對西妥昔單抗耐藥的CRC 細(xì)胞系HKH-2/CR,以及KRAS突變型(KRAS-MT)的CRC 細(xì)胞系HCT116。分別使用遞增濃度的西妥昔單抗處理HKH-2細(xì)胞、HKH-2/CR 細(xì)胞和HCT116 細(xì)胞,采用MTT 方法檢測細(xì)胞增殖活力,使用Graph Pad Prism 繪制細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果表明,藥物濃度和不同細(xì)胞系有交互作用(F藥物=407.50,P＜0.05;F細(xì)胞系=4 981.00,P＜0.05;F藥物×細(xì)胞系=67.57,P＜0.05)。加入西妥昔單抗處理細(xì)胞后,HKH-2/CR細(xì)胞和HCT116細(xì)胞存在明顯耐藥性;而HKH-2細(xì)胞則對西妥昔單抗的處理相對敏感,加入西妥昔單抗后,細(xì)胞生長受到抑制。見圖2A。在HKH-2細(xì)胞中,使用Western blot法分別檢測細(xì)胞在西妥昔單抗(10 nmol/L)處理前及其處理后1、12、24 h的EPHA2和p EPHA2 表達(dá)水平,結(jié)果顯示,西妥昔單抗給藥后EPHA2及p EPHA2表達(dá)水平均明顯上調(diào)。見圖2B。

圖2 西妥昔單抗對3種CRC細(xì)胞增殖活力和EPHA2及pEPHA2表達(dá)的影響

2.3 EPHA2抗體或(和)西妥昔單抗對HKH-2細(xì)胞增殖活力影響

在KRAS-WT 的西妥昔單抗敏感CRC細(xì)胞系HKH-2 中,分別用不同濃度的EPHA2 抗體DS-8895a、西妥昔單抗、DS-8895a聯(lián)合西妥昔單抗處理細(xì)胞,其中聯(lián)合用藥組中DS-8895a的濃度固定為10 nmol/L,采用MTT 法檢測各組細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示,藥物濃度以及不同細(xì)胞系有交互作用(F藥物=1 936.00,P＜0.05;F細(xì)胞系=4 137.00,P＜0.05;F藥物×細(xì)胞系=228.70,P＜0.05)。DS-8895a與西妥昔單抗具有明顯的協(xié)同作用。見圖3。

圖3 EPHA2抗體或(和)西妥昔單抗對HKH-2細(xì)胞增殖活力影響

2.4 EPHA2 抗體或(和)西妥昔單抗對HKH-2/CR 細(xì)胞繼發(fā)耐藥影響

在西妥昔單抗繼發(fā)耐藥的CRC 細(xì)胞系HKH-2/CR 中,分別使用不同濃度的EPHA2 抗體DS-8895a、西妥昔單抗、DS-8895a聯(lián)合西妥昔單抗處理細(xì)胞,其中聯(lián)合用藥組中DS-8895a的濃度固定為10 nmol/L,采用MTT 法檢測各組細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示,藥物濃度和不同細(xì)胞系存在交互作用(F藥物=600.70,P＜0.05;F細(xì)胞系=8 031.00,P＜0.05;F藥物×細(xì)胞系=91.13,P＜0.05)。在對西妥昔單抗繼發(fā)耐藥的CRC 細(xì)胞HKH-2/CR 中,EPHA2抗體DS-8895可能有逆轉(zhuǎn)西妥昔單抗繼發(fā)耐藥的作用。見圖4。

圖4 EPHA2抗體或(和)西妥昔單抗對HKH-2/CR細(xì)胞繼發(fā)耐藥影響

3 討 論

EPH 家族是人類基因組中最大的酪氨酸激酶受體家族,而EPHA2是EPH 家族中的一個重要成員,其在多種上皮來源的組織和細(xì)胞系中廣泛表達(dá)[11]。EPHA2在正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移和治療耐藥中的作用已在多種腫瘤中得到廣泛研究,特別是在乳癌[15]、胰腺癌[16,17]、非小細(xì)胞肺癌[18]、黑色素瘤[19]和頭頸部鱗癌[20]等腫瘤中。在非小細(xì)胞肺癌中,EPHA2的過表達(dá)與EGFR 酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)的治療耐藥相關(guān),抗EPHA2治療可逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥[11]。在頭頸部鱗癌中EPHA2的過表達(dá)與西妥昔單抗的療效相關(guān)[19]。既往我們對于EPHA2 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及意義并不十分了解,但近年來研究結(jié)果顯示,EPHA2可能是促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的驅(qū)動基因,結(jié)直腸癌中EPHA2表達(dá)與西妥昔單抗的療效呈負(fù)相關(guān)[10-11],為西妥昔單抗提供了潛在的療效預(yù)測標(biāo)志物。然而,關(guān)于EPHA2靶向治療能否逆轉(zhuǎn)西妥昔單抗的耐藥尚無深入研究。

本研究在西妥昔單抗治療前及疾病進(jìn)展后配對的腫瘤組織中,觀察到繼發(fā)耐藥后存在EPHA2的表達(dá)上調(diào)。而既往研究多為檢測治療前EPHA2表達(dá)水平對西妥昔單抗療效影響[13,21],即原發(fā)耐藥與EPHA2的關(guān)系,罕見報道EPHA2水平與西妥昔單抗繼發(fā)耐藥的關(guān)系。此外,本研究首次報道了新型EPHA2抗體DS-8895a與西妥昔單抗有協(xié)同增敏作用,而且在繼發(fā)耐藥細(xì)胞系中可逆轉(zhuǎn)西妥昔單抗的耐藥,結(jié)果與MARTINI等[21]報道的EPHA2抗體ALW-II-41-27可逆轉(zhuǎn)西妥昔單抗的結(jié)論一致。因此,我們認(rèn)為EPHA2靶點(diǎn)可能成為結(jié)直腸癌中逆轉(zhuǎn)西妥昔單抗耐藥的一個新方向。目前,EPHA2已逐漸成為多種腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[22],EPHA2抗體DS-8895a在實(shí)體瘤的Ⅰ期臨床研究中表現(xiàn)出了良好的安全性[23],我們期待未來在結(jié)直腸癌病人中驗(yàn)證DS-8895a對西妥昔單抗的逆轉(zhuǎn)耐藥及增敏作用。然而,本研究尚未對EPHA2抗體逆轉(zhuǎn)西妥昔單抗耐藥的機(jī)制做進(jìn)一步的探討。有研究表明,EPHA2受體及配體Ephrin-A1,可形成一個重要的細(xì)胞通訊系統(tǒng)[24],EPHA2可通過調(diào)節(jié)配體依賴性和非配體依賴性信號傳導(dǎo)來抑制和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[20]。在無配體情況下,非配體依賴性的EPHA2通路在RAS/ERK/RSK 下游信號通路中起關(guān)鍵作用[10]。EPHA2抗體逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌西妥昔單抗耐藥的作用機(jī)制仍有待深入探討。

綜上所述,EPHA2 抗體與西妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用可能有逆轉(zhuǎn)西妥昔單抗繼發(fā)耐藥的作用,以及潛在的協(xié)同增敏作用。本研究為結(jié)直腸癌治療中逆轉(zhuǎn)西妥昔單抗耐藥提供了新的理論依據(jù),EPHA2 有可能成為結(jié)直腸癌治療策略的新突破。