劉鑫,徐靜,綦瑤,林高陽,王慧哲,鄒曉

(1 青島大學(xué)附屬青島市中心醫(yī)院乳腺外科,山東 青島 266042;2 青島大學(xué)附屬青島市中心醫(yī)院病理科;3 青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院心胸外科)

乳癌目前仍是全球女性中最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率、死亡率持續(xù)上升,為僅次于肺癌的女性癌癥死亡的第二大原因[1-2]。乳癌綜合治療模式的出現(xiàn)使部分早期、局部晚期、局部復(fù)發(fā)病人被治愈,而一些病人在診斷時已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,5年生存率僅約20%[3]。90%乳癌病人的死亡源于癌轉(zhuǎn)移。乳癌細(xì)胞優(yōu)先侵及肺、骨、肝、腦等器官,其中肺轉(zhuǎn)移治療效果最差,中位生存期僅22個月,在死亡的轉(zhuǎn)移性乳癌病人中肺轉(zhuǎn)移占60%～70%[4-5]。研究乳癌肺轉(zhuǎn)移的機(jī)制,尋找更敏感高效的預(yù)測分子標(biāo)志物和新的治療方法是該領(lǐng)域的核心問題。

Kruppel樣因子5(KLF5)是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中調(diào)控大量基因的表達(dá),在聲門上型喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腎透明細(xì)胞癌以及前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6]。然而,目前關(guān)于KLF5及其下游基因表達(dá)對乳癌肺轉(zhuǎn)移風(fēng)險預(yù)測作用的研究尚無。本研究通過免疫組織化學(xué)的方法檢測KLF5、腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白2(TNFAIP2)和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在不同乳房組織中的表達(dá),分析各因子表達(dá)與乳癌肺轉(zhuǎn)移的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年1月—2016年1月,選擇青島大學(xué)附屬青島市中心醫(yī)院手術(shù)切除且臨床病理資料完整的乳房組織標(biāo)本110 例,其中乳癌肺轉(zhuǎn)移組(A 組)35例,乳癌無肺轉(zhuǎn)移組(B 組)35例,乳房良性腫瘤組(C組)20例,乳癌肺轉(zhuǎn)移癌旁組(D 組)20例。研究納入乳房腫瘤病人均為女性,年齡24～70歲,平均(51.03±11.31)歲;截至2019年9月,隨訪時間27～93月,平均(49.94±20.18)月。組織學(xué)分級根據(jù)改良Scarff-Bloom-Richardson法分為1～3級。根據(jù)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子2(HER-2)、增殖細(xì)胞相關(guān)核抗原(Ki67)等表達(dá)情況將乳癌分為Luminal A 型、Luminal B1型、Luminal B2型、HER-2過表達(dá)型、三陰型(TNBC)[7]。35例乳癌肺轉(zhuǎn)移病人中,25 例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;Luminal A 型2例,Luminal B1型14例,Luminal B2型1例,HER-2過表達(dá)型11例,TNBC 7例。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

入組標(biāo)準(zhǔn):①臨床資料完整,包括一般情況、腫瘤分期(TNM 分期,參考AJCC TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)(第8版))[8]、治療恢復(fù)情況、首發(fā)肺部轉(zhuǎn)移腫瘤的大小(以病理報告腫瘤的最大直徑為準(zhǔn))、位置、數(shù)目等;②經(jīng)穿刺或手術(shù)切除病理(WHO 標(biāo)準(zhǔn))確診為乳癌;③經(jīng)PET-CT 或肺部強(qiáng)化CT、纖維支氣管鏡活檢、穿刺活檢、手術(shù)后病理(WHO 標(biāo)準(zhǔn))檢測確診合并肺轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并原發(fā)肺癌以及其他惡性腫瘤肺轉(zhuǎn)移的病人;②合并有其他嚴(yán)重危及生命的器質(zhì)性病變、其他惡性腫瘤及轉(zhuǎn)移的病人;③病歷資料記錄不完整無法提取重要數(shù)據(jù)者。

1.3 KLF5、TNFAIP2、β-catenin表達(dá)水平檢測

采用免疫組織化學(xué)SP 法。石蠟標(biāo)本4μm 切片,依次置于新鮮二甲苯、無水乙醇、體積分?jǐn)?shù)0.95乙醇、體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇中進(jìn)行脫蠟水化,EDTA抗原修復(fù)液(p H 值8.0,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)修復(fù)。所用一抗為KLF5(ab137676,Abcam,UK;稀釋度1∶200)、TNFAIP2(ab196659,Abcam,UK;稀釋度1∶200)、β-catenin(ab32572,Abcam,UK;稀釋度1∶250),切片加入一抗恒溫(37 ℃)孵育120 min,采用通用SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,SP-9000)檢測,DAB 顯色液(北京索萊寶公司)顯色;蘇木精復(fù)染,封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

結(jié)果判讀由兩位病理專家(主任醫(yī)師)獨立進(jìn)行,采用盲法評分。在光鏡下每張切片隨機(jī)選取10個高倍鏡視野(400 倍),計數(shù)KLF5、TNFAIP2、βcatenin染色情況。KLF5陽性染色以細(xì)胞核為主,TNFAIP2陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)和高爾基體[9],β-catenin陽性染色位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)[10],鏡下表現(xiàn)為棕褐色(強(qiáng)陽)或淺黃色(弱陽)。根據(jù)染色細(xì)胞占比進(jìn)行評分:0 分,＜10%的腫瘤細(xì)胞染色;1分,10%～40%的腫瘤細(xì)胞染色;2分,41%～70%的腫瘤細(xì)胞染色;3 分,＞70%的腫瘤細(xì)胞染色。根據(jù)染色強(qiáng)度評分:0分,陰性;1分,弱;2分,溫和;3分,強(qiáng)。根據(jù)染色強(qiáng)度與染色細(xì)胞占比評分乘積判定免疫反應(yīng)結(jié)果:總分0,免疫反應(yīng)陰性(N);總分1～7分,低免疫反應(yīng)性(L);總分8～12分,高免疫反應(yīng)性(H)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗及Fisher精確檢驗;繪制Kaplan-Meier生存曲線,log-rank法比較各組生存率差異;采用多因素二元Logistic回歸模型分析乳癌肺轉(zhuǎn)移的獨立危險因素,計算風(fēng)險比(HR)和95%置信區(qū)間(CI)。P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同乳房組織KLF5、TNFAIP2 和β-catenin表達(dá)比較

KLF5、TNFAIP2和β-catenin的免疫組織化學(xué)染色見圖1。乳癌肺轉(zhuǎn)移組、乳癌無肺轉(zhuǎn)移組、乳房良性腫瘤組以及乳癌肺轉(zhuǎn)移癌旁組織組KLF5、TNFAIP2和β-catenin表達(dá)比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=25.881、23.669,P＜0.05;P=0.002)。見表1。

表1 不同組織KLF5、TNFAIP2和β-catenin陽性表達(dá)比較(例)

2.2 KLF5、TNFAIP2 和β-catenin 表達(dá)與乳癌病人生存率關(guān)系

log-rank分析顯示,乳癌病人KLF5、TNFAIP2和β-catenin表達(dá)與5 年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率(DFS)(32.4%vs 69.7%,χ2=6.645,P＜0.05;29.0%vs 66.7%,χ2=7.084,P＜0.05;30.4%vs 59.6%,χ2=5.371,P＜0.05)、總生存率(OS)(83.8%vs 97.0%,χ2=4.152,P＜0.05;80.6%vs 97.4%,χ2=5.539,P＜0.05;78.3%vs 95.7%,χ2=7.670,P＜0.05)顯著相關(guān)。見圖2。

圖2 不同KLF5、TNFAIP2和β-catenin表達(dá)水平乳癌病人Kaplan-Meier生存曲線

2.3 乳癌肺轉(zhuǎn)移組TNFAIP2、β-catenin 和KLF5表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

乳癌肺轉(zhuǎn)移組KLF5、TNFAIP2、β-catenin 表達(dá)與其組織學(xué)分級、脈管內(nèi)癌栓有關(guān),TNFAIP2、βcatenin表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(Fisher精確檢驗P=0.001～0.048),β-catenin表達(dá)還與腫瘤大小有關(guān)(Fisher精確檢驗P=0.048);各因子表達(dá)均與年齡、分子亞型、ER、PR、HER-2、Ki67及生存狀態(tài)無關(guān)(P＞0.05)。見表2。

表2 乳癌肺轉(zhuǎn)移病人KLF5、TNFAIP2和β-catenin表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系(n=35,例)

2.4 乳癌病人臨床病理特征對肺轉(zhuǎn)移風(fēng)險的影響

單因素卡方檢驗分析顯示,脈管內(nèi)癌栓(OR=4.231,95%CI=1.550～11.546,P=0.004)、KLF5(OR=4.792,95%CI=1.741～13.188,P=0.002)、TNFAIP2(OR=9.785,95%CI=1.759～13.586,P=0.002)、β-catenin(OR=3.368,95%CI=1.164～9.744,P=0.022)表達(dá)和包塊大小(OR=3.852,95%CI=1.401～10.590,P=0.008)是乳癌發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的危險因素。多因素二元Logistic回歸模型分析顯示,KLF5是乳癌病人發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的獨立預(yù)測因素(HR=3.246,95%CI=1.197～12.046,P=0.034)。二元Logistic回歸模型采用基于最大似然估計的向前逐步回歸法進(jìn)行變量篩選,將無統(tǒng)計學(xué)意義的自變量脈管內(nèi)癌栓、TNFAIP2表達(dá)、βcatenin表達(dá)和包塊大小剔除方程外,有意義的變量解釋為KLF5表達(dá)病人發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的風(fēng)險為KLF5不表達(dá)者的3.246倍。見表3。

表3 單因素和多因素分析乳癌發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的危險因素

2.5 乳癌肺轉(zhuǎn)移病人乳癌組織KLF5、TNFAIP2和β-catenin表達(dá)之間的關(guān)系

本文35例乳癌肺轉(zhuǎn)移病人乳癌組織連續(xù)切片,同一組織進(jìn)行KLF5、TNFAIP2、β-catenin檢測,結(jié)果均為高免疫反應(yīng)性2 例,均為低免疫反應(yīng)性13例,免疫反應(yīng)均陰性8 例,免疫反應(yīng)性不同12 例。相關(guān)分析顯示,KLF5與TNFAIP2(r=0.443,P=0.008)、KLF5 與β-catenin(r=0.501,P=0.002)、TNFAIP2與β-catenin(r=0.492,P=0.003)表達(dá)呈同向性相關(guān)。見表4～6。

表4 乳癌肺轉(zhuǎn)移TNFAIP2和KLF5表達(dá)的關(guān)系(例)

表5 乳癌肺轉(zhuǎn)移β-catenin和KLF5表達(dá)的關(guān)系(例)

表6 乳癌肺轉(zhuǎn)移β-catenin和TNFAIP2表達(dá)的關(guān)系

3 討 論

乳癌特異性肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生與多種因素相關(guān),即通過某種方式影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移前微環(huán)境從而促進(jìn)或抑制乳癌發(fā)生肺部的定向轉(zhuǎn)移,其中包括基因、蛋白、免疫細(xì)胞及相關(guān)信號通路等。研究發(fā)現(xiàn),一些基因和蛋白可作為預(yù)測肺轉(zhuǎn)移風(fēng)險的生物標(biāo)志物,如癌基因同源基因1、轉(zhuǎn)化生長因子-β等[11-12]。KLF5是涉及癌癥許多信號通路的重要調(diào)控因子,其表達(dá)經(jīng)常出現(xiàn)異常,在某些腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌作用,是潛在的腫瘤標(biāo)志物。有研究表明,KLF5與下游靶標(biāo)形成的KLF5-ILK-Ecadherin信號通路通過參與聲門上型喉癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,與局部復(fù)發(fā)顯著相關(guān)[5];KLF5的表達(dá)與乳癌發(fā)生發(fā)展有關(guān),可通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。此外,有研究發(fā)現(xiàn)β-catenin異位表達(dá)能夠促進(jìn)乳癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,與癌細(xì)胞的高侵襲、高轉(zhuǎn)移相關(guān)[13],而KLF5 蛋白或mRNA 與β-catenin在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險最高的TNBC 中明顯共表達(dá)[14]。DEY 等[15]研究也顯示,Wnt/β-catenin通路激活的TNBC,相比其他部位肺轉(zhuǎn)移風(fēng)險更高。而KLF5對于保持Wnt信號通路的完整是必要的,其特異性缺失可降低通路中β-catenin表達(dá)[16]。TNFAIP2為腫瘤相關(guān)炎癥的主要遞質(zhì),在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用,過表達(dá)可通過激活Wnt/β-catenin 信號通路促進(jìn)食管鱗癌的增殖和轉(zhuǎn)移[10],是KLF5的直接下游靶基因。KLF5 可通過上調(diào)TNFAIP2轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)乳癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[17]。但KLF5、TNFAIP2、β-catenin在乳癌肺轉(zhuǎn)移過程中的作用及具體機(jī)制仍不清楚。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測了110例乳房組織標(biāo)本KLF5、TNFAIP2和β-catenin的表達(dá),結(jié)果顯示3個因子表達(dá)水平在乳癌肺轉(zhuǎn)移乳癌組織、乳癌無肺轉(zhuǎn)移乳癌組織、乳房良性腫瘤組織及乳癌肺轉(zhuǎn)移原發(fā)灶癌旁組織之間顯著不同,乳癌肺轉(zhuǎn)移乳癌組織中3個因子的表達(dá)明顯上調(diào)。對這些分子標(biāo)志物表達(dá)水平與肺轉(zhuǎn)移病人的臨床病理學(xué)特征關(guān)系分析顯示,乳癌肺轉(zhuǎn)移組的KLF5、TNFAIP2、β-catenin表達(dá)均與乳癌組織學(xué)分級、脈管內(nèi)癌栓有關(guān),TNFAIP2、β-catenin表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),β-catenin表達(dá)與腫瘤大小有關(guān);各因子表達(dá)均與年齡、分子亞型、ER、PR、HER-2、Ki67及生存狀態(tài)無關(guān)。本研究隨訪結(jié)果顯示,KLF5、TNFAIP2 和βcatenin表達(dá)與DFS、OS 顯著相關(guān),脈管內(nèi)癌栓和KLF5、TNFAIP2、β-catenin表達(dá)及包塊大小是乳癌發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的危險因素,而KLF5表達(dá)是乳癌發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的獨立危險因素。說明KLF5過表達(dá)與乳癌肺轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加有關(guān),可作為預(yù)測乳癌肺轉(zhuǎn)移風(fēng)險的分子標(biāo)志物。

綜上所述,KLF5、TNFAIP2 與β-catenin 在 乳癌肺轉(zhuǎn)移的乳癌組織中高表達(dá)且彼此相關(guān),KLF5-TNFAIP2-β-catenin 途徑與乳癌特異性肺轉(zhuǎn)移有關(guān),KLF5通過調(diào)控相關(guān)蛋白在肺轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。本文研究局限性在于樣本數(shù)量相對偏少,乳癌肺轉(zhuǎn)移與KLF5、TNFAIP2、β-catenin表達(dá)相關(guān)性及具體機(jī)制有待大樣本研究和體外細(xì)胞實驗加以驗證。