張國(guó)榮，李慶杰，劉增霞

(1. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；3. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117)

肌腱連接肌肉與骨骼，承受張力，其屬于致密結(jié)締組織，內(nèi)含有大量縱向排列的膠原纖維束，在纖維束之間存在少量細(xì)胞和血管[1]。過度活動(dòng)可能會(huì)引起肌腱及周圍組織無菌性炎癥反應(yīng)，當(dāng)外來應(yīng)力超過肌腱本身強(qiáng)度時(shí)，肌腱有被撕裂的可能[2]。由于肌腱組織內(nèi)細(xì)胞較少，血液供應(yīng)較差，所以損傷后愈合緩慢，容易發(fā)生重復(fù)斷裂，而且易與周圍組織粘連[3]。斷裂肌腱的治療手段主要是手術(shù)縫合，配合理療促進(jìn)功能恢復(fù)[4-5]。如果發(fā)生組織缺損，則需要進(jìn)行自體移植或異體移植，但由于供體有限和免疫排斥等因素影響，肌腱損傷修復(fù)的治療效果一直不甚理想，是臨床的難題之一。組織工程與細(xì)胞治療技術(shù)的發(fā)展為肌腱損傷修復(fù)帶來新的希望，組織工程肌腱是將種子細(xì)胞在體外培養(yǎng)增殖后，種植在支架材料上，在多種因素影響下，二者結(jié)合形成肌腱樣組織復(fù)合物，肌腱細(xì)胞是肌腱組織內(nèi)的細(xì)胞成分，具有合成和分泌膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，維持肌腱組織新陳代謝的作用，故可以用于肌腱缺損修復(fù)[6-7]。也有研究者嘗試用各種生長(zhǎng)因子促進(jìn)肌腱愈合[8-9]。鹿茸是名貴中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》最早記錄鹿茸能加速創(chuàng)傷愈合，《本草綱目》記載鹿茸能生精補(bǔ)髓、養(yǎng)血益陽(yáng)、強(qiáng)筋健骨。鹿茸多肽是從鹿茸中分離純化出的多肽生長(zhǎng)因子，其具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白分泌的作用[10]。本研究在應(yīng)用肌腱細(xì)胞構(gòu)建組織工程肌腱治療大鼠髕韌帶缺損的基礎(chǔ)上加入鹿茸多肽，探討其是否有利于肌腱細(xì)胞增殖和膠原蛋白分泌，促進(jìn)損傷肌腱修復(fù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只健康SD大鼠，體重200～250 g，購(gòu)于長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-(吉)2018-0007。常規(guī)飼養(yǎng)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，普通飲食，自由飲水，室溫(22±2)℃，相對(duì)濕度(55±5)%，自然晝夜節(jié)律光照。

1.2組織工程肌腱的制備 在無菌環(huán)境下取SD大鼠跟腱，剝離肌腱腱膜，用手術(shù)剪將組織剪成勻漿狀。取適量(1 mL/mm3)混合膠原酶加入培養(yǎng)皿中，放入37 ℃培養(yǎng)箱中消化4 h。加入含血清(10%FBS)的低糖培養(yǎng)基將膠原酶濃度稀釋到0.5%,37 ℃消化過夜。1 500 ×g離心5 min，棄上清，加入低糖培養(yǎng)基(10%FBS，1%抗生素)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代細(xì)胞4～5 d貼壁，貼壁后3 d更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)皿底大約90%時(shí)，傳代培養(yǎng)。常規(guī)凍存復(fù)蘇細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)應(yīng)用五代以內(nèi)的大鼠肌腱細(xì)胞。參照文獻(xiàn)[11]培養(yǎng)大鼠肌腱細(xì)胞，培養(yǎng)基中加入1%維生素C，以促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，并防止細(xì)胞老化。3 d更換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周后，在培養(yǎng)皿底部逐漸形成連續(xù)的細(xì)胞片。使用1 mL移液器槍頭用向上的剪切力慢慢卷起細(xì)胞片，形成圓柱形組織。繼續(xù)培養(yǎng)1周，細(xì)胞片的光滑面與粗糙面就會(huì)充分融合，形成組織工程肌腱。

1.3組織工程肌腱的微細(xì)結(jié)構(gòu)檢測(cè) 取組織工程肌腱，PBS潤(rùn)洗，10%甲醛溶液固定24 h。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟浸潤(rùn)，縱向包埋。7 μm厚連續(xù)切片，分別進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色和三色(Masson)染色。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。在光學(xué)顯微鏡下觀察組織微細(xì)結(jié)構(gòu)。HE染色顯示組織工程肌腱中細(xì)胞生長(zhǎng)良好，大致成行分布，細(xì)胞外基質(zhì)豐富，排列較疏松，Masson染色顯示組織工程肌腱有成束的、連續(xù)的波浪狀膠原纖維生成即為合格。

1.4鹿茸多肽處理組織工程肌腱 鹿茸多肽由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供。按鹿茸多肽與組織工程肌腱質(zhì)量比為1.5%計(jì)算[12]，將鹿茸多肽粉末溶解于適量PBS溶液中，將組織工程肌腱放入其中，充分浸潤(rùn)鹿茸多肽溶液。

1.5動(dòng)物分組、造模及干預(yù) 將36只SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組12只，每只大鼠均在左側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)進(jìn)行手術(shù)操作。模型組在髕韌帶上做1 mm×4 mm全層窗口缺損，直接縫合，自然修復(fù)。組織工程組在髕韌帶缺損處植入組織工程肌腱修復(fù)缺損組織，組織工程復(fù)合鹿茸多肽組在髕韌帶缺損處植入用鹿茸多肽處理過的組織工程肌腱修復(fù)缺損組織，然后縫合膝關(guān)節(jié)囊、肌肉筋膜組織和皮膚切口，包扎處理。術(shù)后連續(xù)3 d每日肌肉注射80萬(wàn)IU青霉素。標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，每日紫外線消毒。每天觀察動(dòng)物飲食、活動(dòng)、步態(tài)、傷口愈合情況、有無感染征象等。

1.6檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1大體觀察 術(shù)后4周，處死各組大鼠，觀察肌腱缺損部位修復(fù)情況，包括修復(fù)程度、表面平整度、顏色變化、與周圍正常肌腱的整合情況、有無裂隙等。

1.6.2組織學(xué)觀察 取大鼠髕韌帶缺損處修復(fù)組織，制作石蠟切片，分別進(jìn)行HE染色和Masson染色，用光學(xué)顯微鏡觀察修復(fù)組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)。

1.6.3膠原含量測(cè)定 精確稱取濕重50 mg的修復(fù)組織，放入10 mL試管中，加入水解液1.0 mL，混勻。加蓋后沸水浴水解20 min，中間混勻1次。流水冷卻，加指示劑1滴，混勻。加入調(diào)pH甲液1.0 mL，混勻，此時(shí)溶液為紅色。逐滴加入調(diào)pH乙液，及時(shí)混勻，直至液體變?yōu)辄S綠色，此時(shí)pH值在6.0～6.8。向管內(nèi)加蒸餾水至10 mL，混勻，取3 mL液體加20～30 mg活性炭，混勻，3 500 r/min(離心半徑13.5 cm)離心10 min，上清液澄清無色即可，取上清1 mL做檢測(cè)。空白管加蒸餾水1 mL，標(biāo)準(zhǔn)管加5 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液1 mL，測(cè)定管加檢測(cè)液1 mL，每管中加試劑一各0.5 mL混勻，靜置10 min，然后每管中加試劑二各0.5 mL混勻，靜置5 min，加試劑三各0.5 mL混勻，60 ℃水浴15 min，冷卻后，3 500 r/min(離心半徑13.5 cm)離心10 min，取上清200 μL用酶標(biāo)儀在550 nm處測(cè)定吸光度。羥脯氨酸含量(μg/mg 濕重)=(測(cè)定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)管含量(5 μg/mL)×水解液總體積(10 mL)/組織濕重(mg)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠修復(fù)組織大體情況 術(shù)后4周，3組大鼠膝關(guān)節(jié)無腫脹、積液和感染征象。模型組修復(fù)組織外觀不平整，周圍組織有皺縮現(xiàn)象；組織工程組修復(fù)組織較平整；組織工程復(fù)合鹿茸多肽組修復(fù)組織平整光滑。見圖1。

圖1 各組大鼠術(shù)后4周肌腱缺損部位修復(fù)情況

2.2各組大鼠修復(fù)組織HE染色和Masson染色表現(xiàn) 術(shù)后4周， HE染色顯示：模型組生成較多瘢痕組織；組織工程組組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，但組織工程肌腱與大鼠原有肌腱組織之間存在縫隙；組織工程復(fù)合鹿茸多肽組修復(fù)組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)規(guī)則良好，縫隙較小。Masson染色顯示：組織工程組與組織工程復(fù)合鹿茸多肽組均生成較多膠原纖維(藍(lán)色)，而模型組膠原纖維較少。見圖2。

圖2 各組大鼠術(shù)后4周肌腱缺損部位修復(fù)組織HE染色和Masson染色表現(xiàn)

2.3各組大鼠修復(fù)組織中膠原含量比較 模型組、 組織工程組、組織工程復(fù)合鹿茸多肽組膠原含量分別為(11.292±3.194)μg/g、(14.811±2.547)μg/g、(17.013±2.098)μg/g，組織工程組、組織工程復(fù)合鹿茸多肽組膠原含量均明顯高于模型組(P均<0.05)，組織工程復(fù)合鹿茸多肽組明顯高于組織工程組(P<0.05)。

3 討 論

肌腱缺損修復(fù)一直是臨床的難題，過去主要采用自體肌腱移植或同種異體肌腱移植的方法修復(fù)肌腱缺損，均能取得一定療效，但是，切取肌腱組織會(huì)造成新的損傷，供體有限和免疫排斥等因素使臨床應(yīng)用受到限制。1993年，科學(xué)家提出利用組織工程技術(shù)制造組織損傷修復(fù)的替代材料[13]，為肌腱損傷修復(fù)提供了新的治療方法。利用支架材料構(gòu)建組織工程肌腱能夠增加力學(xué)強(qiáng)度，但也存在一些問題，如細(xì)胞增殖分化效率低、生物兼容性差、降解速度與修復(fù)速度不匹配等[14]。細(xì)胞片技術(shù)可以更好地保留細(xì)胞間連接和細(xì)胞生存微環(huán)境，能夠用于缺損組織修復(fù)[15]。本研究體外培養(yǎng)大鼠肌腱細(xì)胞，利用維生素C誘導(dǎo)端粒酶的活性增加細(xì)胞外基質(zhì)分泌[16]，構(gòu)建無支架的組織工程肌腱。組織工程肌腱中細(xì)胞外基質(zhì)分泌豐富，較疏松地呈縱向排列，細(xì)胞分布于細(xì)胞外基質(zhì)之間。Masson染色顯示組織工程肌腱中有連續(xù)的呈波浪狀的膠原纖維，說明構(gòu)建的組織工程肌腱具有不成熟肌腱的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。用組織工程肌腱修復(fù)大鼠髕韌帶缺損，結(jié)果顯示修復(fù)組織的大體結(jié)構(gòu)和組織學(xué)結(jié)構(gòu)優(yōu)于只做縫合處理的模型組，修復(fù)組織的膠原含量較高。說明無支架的組織工程肌腱雖然力學(xué)強(qiáng)度不高，但用其填補(bǔ)髕韌帶缺損，可以幫助缺損部位盡快修復(fù)。另外，該組織工程肌腱不含任何人工合成材料，制作簡(jiǎn)單方便，具有更好的生物兼容性，用于治療肌腱損傷修復(fù)具有一定可行性。

鹿茸多肽的藥理作用廣泛，已有研究者將其應(yīng)用于免疫調(diào)節(jié)、冠心病、骨質(zhì)疏松、神經(jīng)損傷、皮膚損傷等的治療研究[17-21]，但其用于肌腱損傷修復(fù)的報(bào)道還比較少。徐效義等[22]實(shí)驗(yàn)證實(shí)局部應(yīng)用鹿茸多肽-PLGA復(fù)合膜能減輕肌腱術(shù)后粘連，促進(jìn)肌腱愈合。王琦等[10]研究顯示鹿茸多肽能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和促進(jìn)膠原蛋白分泌，其機(jī)制可能與激活ERK 1/2磷酸化及增加TGF-β1表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)將組織工程肌腱復(fù)合鹿茸多肽修復(fù)大鼠髕韌帶缺損，結(jié)果顯示修復(fù)組織的大體結(jié)構(gòu)和組織學(xué)結(jié)構(gòu)優(yōu)于未用鹿茸多肽處理的組織工程組和模型組，且修復(fù)組織中膠原含量更高，說明鹿茸多肽對(duì)大鼠髕韌帶缺損的修復(fù)有促進(jìn)作用，原因可能為促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖和(或)促進(jìn)膠原蛋白分泌。后續(xù)將進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，探索鹿茸多肽對(duì)肌腱細(xì)胞增殖及膠原蛋白分泌能力的影響及可能機(jī)制。

綜上，本研究探索了無支架組織工程肌腱和中藥鹿茸多肽對(duì)肌腱損傷修復(fù)的促進(jìn)作用，獲得了有用的生物學(xué)信息，希望對(duì)肌腱損傷修復(fù)的研究產(chǎn)生一定促進(jìn)作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。