劉 雨，施麗婕，楊 潔，耿 潔，柴士偉

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 300193；2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300000)

潰瘍性結(jié)腸炎是一種侵及結(jié)腸黏膜的慢性非特異性炎性疾病，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、體重減輕等，部分患者會(huì)出現(xiàn)腸病性關(guān)節(jié)炎、肝膽管疾病等腸外表現(xiàn)[1]。潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制尚未明確,多認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展與遺傳、免疫、環(huán)境、飲食等多種危險(xiǎn)因素相關(guān)。多因素共同作用易觸發(fā)上皮屏障功能的改變，導(dǎo)致免疫細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，細(xì)胞因子作為信號(hào)分子可通過(guò)產(chǎn)生炎癥介質(zhì)和激活炎癥途徑參與潰瘍性結(jié)腸炎的病理性進(jìn)展[2-3]。目前西醫(yī)常用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、氨基水楊酸等藥物治療潰瘍性結(jié)腸炎，但對(duì)于少數(shù)嚴(yán)重的復(fù)發(fā)性或慢性無(wú)緩解的患者缺乏有效治療方式，糖皮質(zhì)激素可能存在依賴(lài)和抵抗，采用單純的西藥治療效果并不理想，越來(lái)越多的臨床工作者轉(zhuǎn)向研究中醫(yī)中藥治療。本課題組前期研究表明潰瘍性結(jié)腸炎的主要病機(jī)為衛(wèi)陽(yáng)郁滯，瘀阻腸絡(luò)，以此立論的化瘀通陽(yáng)方組方精簡(jiǎn)，治療潰瘍性結(jié)腸炎療效顯著[4]。本研究通過(guò)建立潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，觀察化瘀通陽(yáng)方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血清白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、干擾素-γ(IFN-γ)表達(dá)的影響，以探討其治療的免疫機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)Wistar大鼠32只，8周齡，體重(190±10)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2016-0006，常規(guī)飼養(yǎng)于屏障隔離環(huán)境中，12 h光照/黑夜循環(huán)，溫度20～24 ℃，濕度40%～60%；自由飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 化瘀通陽(yáng)方藥物組成：蒲黃10 g、五靈脂10 g、薤白10 g，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。參照徐叔云教授主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》劑量換算方法計(jì)算，成人體重按70 kg估算，大鼠體重按200 g估算，得出大鼠用藥的等效劑量相當(dāng)于成人的6.3倍。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)以5.4 g/kg的化瘀通陽(yáng)方給藥改善腸黏膜炎癥效果顯著，大鼠灌胃容積為10 mL/kg，相應(yīng)藥物濃度為0.54 g/mL，故按照中藥常規(guī)煎法制成該濃度的藥液，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。美沙拉嗪灌腸液(德國(guó)莎爾福Falk藥廠，批號(hào)：17B16)，同樣按人與動(dòng)物等劑藥物量換算方法，得出大鼠的適宜用藥劑量為0.36 g/kg，相應(yīng)藥物濃度為 0.036 g/mL，用無(wú)菌飲用水稀釋原藥液至此濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑 葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS，美國(guó)MP公司，批號(hào)：18008540530)，生理鹽水(天津博泰億達(dá)生物科技有限公司)，無(wú)水乙醇、冰醋酸、鄰聯(lián)甲苯胺、30%過(guò)氧化氫溶液(天津博泰億達(dá)生物科技有限公司)，PBS緩沖液，大鼠IL-1β、IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，EK0393)，4%多聚甲醛(天津博泰憶達(dá)生物科技有限公司)，蘇木素-伊紅染色液、二甲苯溶液(北京百浩生物有限公司)。

1.4主要儀器 移液槍(Dragon Medical Company Limitied)，顯微鏡(日本歐林巴斯公司)，切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)，脫水機(jī)(美國(guó)賽默飛公司)，包埋機(jī)(美國(guó)賽默飛公司)，低溫離心機(jī)，多功能酶標(biāo)儀，恒溫箱。

1.5造模、分組及干預(yù) 隨機(jī)選取8只大鼠作為空白組，自由飲用蒸餾水；余24只大鼠采用 DSS 自由飲用結(jié)合灌胃方法[5-6]建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，具體操作：配制5%的DSS溶液，大鼠自由飲用及每只每日4 mL灌胃1次，連續(xù)7 d。所有大鼠均正常飲食,造模大鼠中死亡3只，空白組大鼠無(wú)死亡。造模第7天結(jié)束后，隨機(jī)抽取4只造模大鼠和空白組2只大鼠處死，取結(jié)腸組織制作病理切片，鏡下對(duì)照觀察，用以判斷大鼠模型是否建立成功。將造模成功的17只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組5只、美沙拉嗪組6只、化瘀通陽(yáng)方組6只?；鐾?yáng)方組予0.54 g/mL化瘀通陽(yáng)方藥液灌腸，美沙拉嗪組予0.036 g/mL美沙拉嗪灌腸液灌腸，模型組和空白組予生理鹽水灌腸，均每日1次，每次2 mL，連續(xù)灌腸10 d。

1.6觀察指標(biāo)及方法

1.6.1一般狀況及疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI) 觀察造模及灌腸期間大鼠的精神狀態(tài)、進(jìn)食量、活動(dòng)情況、皮毛情況(密度、光澤等)，并記錄每日每只大鼠的體重，每日通過(guò)腹部按摩法促使大鼠排便，于肛周消毒后自大鼠肛門(mén)處無(wú)菌采集糞便，觀察大便性狀，并采用鄰聯(lián)甲苯胺法[7]進(jìn)行便隱血檢測(cè)。參照Cooper等[8]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DAI評(píng)分：體重、大便性狀正常，便隱血陰性記0分；體重下降1%～5%，松散便，隱血(+)記1分；體重下降6%～10%，松散便，隱血()記2分；體重下降11%～15%，稀便，隱血()記3分；體重下降> 15%，稀便，肉眼血便記4分。DAI =(體重下降率分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3。

1.6.2血清中IL-1-β、IFN-γ水平 灌腸10 d結(jié)束后，各組大鼠禁食不禁水24 h，稱(chēng)重后予10%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，股動(dòng)脈取血4 mL置于無(wú)菌干燥采血管中，室溫靜置分層后，4 ℃低溫離心10 min(2 500 r/min)提取血清，保存于-20 ℃冰箱。按試劑盒說(shuō)明采用ELISA法檢測(cè)：預(yù)先采用IL-1β、IFN-γ單抗包被于酶標(biāo)板上，加入生物素抗大鼠 IL-1β/IFN-γ抗體，樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后，PBS 洗滌。隨后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng)；TMB 在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在終止液硫酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出樣本中IL1-β、IFN-γ的濃度， IL-1β/IFN-γ濃度與吸光值呈正相關(guān)。

1.6.3結(jié)腸大體損傷指數(shù)(CMDI) 采血后采用頸椎脫臼法處死大鼠，取全結(jié)腸沿腸系膜縱軸剖開(kāi)，PBS緩沖液沖洗干凈，肉眼下觀察黏膜損傷狀態(tài)，測(cè)量潰瘍面積，根據(jù)結(jié)腸黏膜充血、水腫、糜爛、潰瘍、壞死等情況進(jìn)行評(píng)分。0分：結(jié)腸無(wú)損傷；1分：結(jié)腸輕度充血、水腫，表面光滑；2分：結(jié)腸明顯充血水腫,黏膜粗糙呈顆粒狀，有糜爛或腸粘連；3分：高度充血水腫，黏膜表面潰瘍形成,潰瘍最大縱徑<1.0 cm；4分：在3分基礎(chǔ)上潰瘍最大縱徑>1.0 cm，或全腸壁壞死。

1.6.4結(jié)腸組織學(xué)觀察及組織學(xué)損傷指數(shù)(TDI)選取黏膜損傷明顯處大小約1 cm×1 cm、厚度約3 mm的結(jié)腸組織，4%多聚甲醛固定后，將組織在流動(dòng)水下沖洗20 min，置于不同濃度的乙醇溶液中脫水，石蠟包埋組織，切片(厚度3 μm)，蘇木素-伊紅染色，乙醇溶液中脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明，用中性樹(shù)膠封片，根據(jù)鏡下組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行光鏡下鏡檢和評(píng)分。TDI評(píng)分包括2部分：上皮細(xì)胞形態(tài)正常記0分，有杯狀細(xì)胞丟失記1分，杯狀細(xì)胞大面積丟失記2分，隱窩細(xì)胞丟失記3分，隱窩細(xì)胞大面積丟失記4分；炎細(xì)胞浸潤(rùn)無(wú)記0分，浸潤(rùn)在隱窩基底層記1分，浸潤(rùn)到達(dá)黏膜肌層記2分，浸潤(rùn)深入到黏膜肌層伴黏膜增厚和明顯水腫記3分，浸潤(rùn)到達(dá)黏膜下層記4分。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，若兩項(xiàng)檢驗(yàn)均符合，多個(gè)樣本組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況及DAI評(píng)分比較 空白組大鼠活動(dòng)靈活，反應(yīng)敏捷，飲食及大便正常，皮毛光滑，體重自然增加；模型組大鼠逐漸出現(xiàn)懶動(dòng)、嗜睡、反應(yīng)遲鈍，皮毛干枯無(wú)光，飲水及進(jìn)食量減少，大便帶血或膿血便，體重明顯減輕。化瘀通陽(yáng)方組和美沙拉嗪灌組大鼠在灌腸10 d后精神逐漸恢復(fù)，活動(dòng)增加，飲食量漸增，大便性狀改善，隱血消失。模型組大鼠造模第7天和灌腸干預(yù)第10天DAI評(píng)分均高于空白組(P均<0.05)，化瘀通陽(yáng)方組和美沙拉嗪灌組均明顯低于模型組(P均<0.05)，化瘀通陽(yáng)方組與美沙拉嗪組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠造模第7天和灌腸第10天DAI評(píng)分比較分)

2.2各組大鼠血清中IL-1β、IFN-γ水平比較模型組大鼠血清中IL-1β、IFN-γ水平均明顯高于空白組(P均<0.05)，美沙拉嗪組與化瘀通陽(yáng)方組均明顯低于模型組(P均<0.05)，化瘀通陽(yáng)方組與美沙拉嗪組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中IL-1β、IFN-γ水平比較

2.3各組大鼠結(jié)腸黏膜組織大體及HE染色表現(xiàn)空白組大鼠解剖后結(jié)腸黏膜正常；模型組大鼠結(jié)腸黏膜色暗，腸管呈現(xiàn)不同程度的充血和水腫，腸壁黏膜散在潰瘍?cè)?，周邊充血或糜爛；化瘀通陽(yáng)方組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸黏膜存在輕度的充血水腫，可見(jiàn)潰瘍愈合的瘢痕，潰瘍周?chē)つの匆?jiàn)明顯充血水腫。

病理切片HE染色可見(jiàn)空白組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰，杯狀細(xì)胞豐富，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1；模型組大鼠可見(jiàn)黏膜固有層腺體結(jié)構(gòu)被破壞，杯狀細(xì)胞大量丟失，炎性細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)達(dá)到黏膜下層，見(jiàn)圖2；化瘀通陽(yáng)方組和美沙拉嗪組大鼠可見(jiàn)局部上皮修復(fù)和腺體不同程度的改善，炎細(xì)胞浸潤(rùn)面積明顯減少，見(jiàn)圖3和圖4。

圖1 正常組大鼠結(jié)腸黏膜組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖2 模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖3 美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸黏膜組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖4 化瘀通陽(yáng)方組大鼠結(jié)腸黏膜組織HE染色表現(xiàn)(×400)

2.4各組大鼠結(jié)腸黏膜組織CMDI評(píng)分與TDI評(píng)分比較 模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織CMDI評(píng)分與TDI評(píng)分均明顯高于空白組(P均<0.05)，美沙拉嗪組與化瘀通陽(yáng)方組均明顯低于模型組(P均<0.05)，化瘀通陽(yáng)方組與美沙拉嗪組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織CMDI評(píng)分與TDI評(píng)分比較分)

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及遺傳易感性、環(huán)境和免疫反應(yīng)等多方面。上皮屏障功能受損打開(kāi)了免疫反應(yīng)的第一道防線(xiàn)，共生細(xì)菌和微生物產(chǎn)物從腸腔經(jīng)上皮層進(jìn)入固有層，啟動(dòng)宿主免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。細(xì)胞因子作為信號(hào)分子參與細(xì)胞激活和分化等多種生物學(xué)過(guò)程，不僅推動(dòng)腸道炎癥進(jìn)展，還可調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎的腸外表現(xiàn)和全身效應(yīng)。根據(jù)細(xì)胞因子在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的不同作用分為促炎細(xì)胞因子、抗炎細(xì)胞因子兩種類(lèi)型。本研究測(cè)定的IL-1β是促炎細(xì)胞因子IL-1的主要循環(huán)形式，涉及廣譜的炎性疾病，其表達(dá)、激活及分泌主要與單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞亞群相關(guān)[9]。在炎癥性腸病中，IL-1β能夠通過(guò)募集粒細(xì)胞和激活CD4+T細(xì)胞，增加IL-17A、IL-12、IFN-γ等促炎因子的產(chǎn)生，加重腸道炎癥[10-11]。Mao等[12]研究表明，腸固有層中的IL-1β能與IL-6協(xié)同作用，誘導(dǎo)幼稚T細(xì)胞分化為T(mén)h17 T細(xì)胞(分泌IL-17)或下游的T細(xì)胞(分泌IFN-γ)，共同介導(dǎo)腸固有層的炎癥變化。IFN-γ作為Ⅱ型干擾素的唯一成員也是常見(jiàn)的促炎性細(xì)胞因子，主要由自然殺傷細(xì)胞(NK)及輔助性T細(xì)胞(Th1)產(chǎn)生。在機(jī)體的固有免疫中，IFN-γ是巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及NK細(xì)胞重要的募集激活劑，可促進(jìn)Ⅱ型主要組織相容性復(fù)合物(MHCⅡ)的表達(dá)，促進(jìn)Th1細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞活化與增殖，從而參與體內(nèi)的炎癥反應(yīng)[13-14]。另有研究表明IFN-γ能與TNF-α協(xié)同作用，通過(guò)刺激基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)、誘導(dǎo)一氧化氮的合成而對(duì)結(jié)腸黏膜產(chǎn)生損害[15]。

潰瘍性結(jié)腸炎屬中醫(yī)“泄瀉”“腸澼”“痢疾”“腸風(fēng)”等范疇，多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為素體脾虛是潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病基礎(chǔ)，濕邪(熱)、瘀熱、熱毒、痰濁、氣滯、血瘀等為常見(jiàn)病理因素。衛(wèi)氣來(lái)源于脾胃運(yùn)化所生的水谷精微，是人體陽(yáng)氣的一部分，故又稱(chēng)為“衛(wèi)陽(yáng)”。本課題組前期理論研究認(rèn)為衛(wèi)氣慓疾滑利、游竄迅速，主管人體防御功能，與西醫(yī)免疫細(xì)胞的分布循行和免疫功能非常相似。腸道中的免疫細(xì)胞分布于黏膜及黏膜下層，執(zhí)行免疫防御、免疫監(jiān)視的功能。若衛(wèi)氣郁痹，衛(wèi)陽(yáng)失宣，人體抵御病邪的能力減弱，無(wú)以固護(hù)腸道，衛(wèi)不偕營(yíng)，營(yíng)衛(wèi)交會(huì)生化失常，營(yíng)血不能得到有序的氣化溫通，阻滯脈道，損傷腸絡(luò)，久則氣滯血澀，血滯為瘀。因此，導(dǎo)師基于中西醫(yī)理論認(rèn)為衛(wèi)陽(yáng)郁滯、瘀阻腸絡(luò)是潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵病機(jī)，針對(duì)此病機(jī)，施麗婕教授自擬化瘀通陽(yáng)方，方中薤白溫通衛(wèi)陽(yáng)、理氣散結(jié)，五靈脂與蒲黃相須為用化瘀止血、活血止痛，三藥合用，共奏溫通散結(jié)、化瘀止痛之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，薤白中分離的皂苷類(lèi)化合物Macrostemonoside F有明顯的抗炎活性，可通過(guò)增強(qiáng)吞噬細(xì)胞活性提高小鼠的免疫功能[16-17]；五靈脂活血化瘀,胡小松等[18]測(cè)定了五靈脂的菌群及豐度，表明厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)占優(yōu)勢(shì)地位，且存在較高豐度的產(chǎn)短鏈脂肪酸相關(guān)菌，有益于腸道健康；蒲黃具有化瘀止血作用，蒲黃醇提液對(duì)小鼠化學(xué)刺激和物理刺激致痛都有明顯的鎮(zhèn)痛作用，大劑量蒲黃可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能，提高小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫功能[19]。

本研究利用5%DSS溶液成功制備潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，經(jīng)化瘀通陽(yáng)方干預(yù)后，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體重、精神狀態(tài)、進(jìn)食量、皮毛及糞便性狀等均得到顯著改善，鏡下觀察結(jié)腸黏膜損傷好轉(zhuǎn)，血清中IL-1β、IFN-γ水平顯著降低。提示化瘀通陽(yáng)方可能通過(guò)減少I(mǎi)L-1β、IFN-γ等促炎因子的表達(dá)，從而減輕結(jié)腸黏膜的炎癥，修復(fù)腸組織損傷，對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎起到較好的治療作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。