康莉，李揮，刁立琴，付釗，高保栓，王志永，郭亞秋，馮毅（通信作者）

河北省醫(yī)療器械與藥品包裝材料檢驗研究院 （河北石家莊 050227）

生物負載指一件產(chǎn)品和（或）包裝上或其中存活的微生物總數(shù)[1]。多年來，在醫(yī)療器械質(zhì)量控制方面，針對滅菌前后、產(chǎn)品的微生物檢驗，通常將重點放在無菌檢驗上，而忽視了對產(chǎn)品生物負載的檢測[2]。產(chǎn)品在滅菌前自然形成的生物負載（初始污染菌）的高低反映了生產(chǎn)環(huán)境的控制能力[3]；若生物負載測定結(jié)果不準確，則不僅會影響滅菌參數(shù)的設(shè)定，還會影響產(chǎn)品質(zhì)量，直接關(guān)系到產(chǎn)品最終的整體安全性能，同時可將其作為醫(yī)用材料安全性評價的重要指標，甚至會涉及患者的人體安全；若生物負載水平增高，則會導致滅菌難度加大、滅菌不徹底、微生物的尸體過多，以及使用者出現(xiàn)炎癥、發(fā)熱等病理反應。由于醫(yī)療器械產(chǎn)品的種類繁多，因此，根據(jù)產(chǎn)品特性選擇合適的生物負載檢測方法非常重要。

醫(yī)用脫脂棉作為被廣泛應用的衛(wèi)生材料，屬于軟質(zhì)纖維材料，有很強的吸附性，且微生物對其表面的附著度較高；對于非無菌供應的醫(yī)用脫脂棉，生物負載可以作為醫(yī)療單位滅菌時確定滅菌參數(shù)的重要依據(jù)。

在醫(yī)療器械的微生物檢驗中，將法定的標準及方法作為參照十分重要[4]。YY/T 0330-2015《醫(yī)用脫脂棉》[5]4.14中指出，我們應按GB/T 19973.1-2015《醫(yī)療器械的滅菌 微生物學方法 第1部分：產(chǎn)品上微生物總數(shù)的測定》[1]規(guī)定的方法進行生物負載試驗，但GB/T 19973.1-2015中并未針對該產(chǎn)品給出具體的操作方法，附錄中只有生物負載測定方法的設(shè)計要求及對所設(shè)計的方法進行確認的指南，基于此，本研究依據(jù)標準附錄對醫(yī)用脫脂棉的生物負載進行了方法學研究。

1 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌器（三洋電機國際貿(mào)易有限公司，MLS-3750型）；生物安全柜（濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司，BSC-1500ⅡB2-X 型）；微生物限度過濾系統(tǒng)（法國/默克，ZW-600型）；無菌均質(zhì)器（寧波新芝生物科技有限公司，SCIENTZ-04型）；生化培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司，ZXSD-B1160型）；低溫生化培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司，ZXSP-A0160型）；電子天平（德國賽多利斯，TE212-L 型）。

2 材料與試劑

醫(yī)用脫脂棉[邢臺太行醫(yī)用材料有限公司（批號：190106），石家莊市宏運衛(wèi)生材料廠（批號：20181108），河北康濟藥械有限公司（批號：181218）]；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號：180427）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號：180912）；0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，規(guī)格：500 ml，批號：1802113204）。

3 修正系數(shù)的測定

依據(jù)GB/T 19973.1-2015附錄B.2.2.1袋蠕動法，在無菌環(huán)境下，取邢臺太行醫(yī)用材料有限公司樣品5個包裝，從每個包裝中取樣，準確量取3份樣品，每份（1.0±0.1）g，放入無菌均質(zhì)袋中分別作為樣1、樣2、樣3，3份樣品分別加入100 ml 0.9%氯化鈉注射液至設(shè)定均質(zhì)器的洗脫參數(shù)，推薦將洗脫參數(shù)設(shè)定為拍擊頻率6次/s，運行時間60 s，啟動均質(zhì)器，使洗脫液貫穿試樣內(nèi)外，均質(zhì)1 min，然后取洗脫液進行薄膜過濾，將每份試樣的洗脫液分別通過薄膜過濾等量、完全過濾到2張濾膜上，之后用100 ml 0.9%氯化鈉注射液對每張濾膜進行沖洗（每份試樣按上述方法共洗脫10次，其余兩家的樣品按照同法操作）；將濾膜菌面朝上分別放置在胰酪大豆胨瓊脂平板和沙氏葡萄糖瓊脂平板上，將洗脫后的試樣放置在空的平板中，倒入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基進行瓊脂覆蓋，使胰酪大豆胨瓊脂平板在30～35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d、沙氏葡萄糖瓊脂平板在20～25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，取出，觀察計數(shù)。按公式（1）計算試樣每次洗脫的菌落數(shù)（colony forming units，CFU）：

其中，Xi為試樣第i次洗脫的CFU，i=1，2，3…10；Ai為試樣第i次洗脫的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板CFU，i=1，2，3…10；Bi為試樣第i次洗脫的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板CFU，i=1，2，3…10。

計算結(jié)果見表1～3。

表1 邢臺太行醫(yī)用材料有限公司重復洗脫10次后的CFU

表2 石家莊市宏運衛(wèi)生材料廠重復洗脫10次后的CFU

表3 河北康濟藥械有限公司重復洗脫10次后的CFU

依據(jù)表1～3的總CFU 計算回收率，即洗脫1次的回收率為第1次洗脫的CFU 與總CFU 的百分比，洗脫2次的回收率為第1次洗脫的CFU 與第2次洗脫的CFU 之和與總CFU的百分比，見表4。

表4 不同廠家不同樣品洗脫1次及2次的回收率（%）

依據(jù)洗脫2次后的平均回收率，按公式（2）計算修正系數(shù)：

P=1÷[（83.1%＋84.0%＋82.2%）÷3]=1.20 （2）其中，P為修正系數(shù)。

4 生物負載的計算

在無菌環(huán)境下，取待測樣品5個包裝，從每個包裝中取樣，準確量取3份樣品，每份（1.0±0.1）g，分別作為樣1、樣2、樣3；按修正系數(shù)測定所采用的方法，將待測樣品的3個試樣分別洗脫2次，先計算每個試樣洗脫2次的菌落總數(shù)（M1、M2、M3），然后計算M1+M2+M3的平均值M。按公式（3）計算生物負載：

其中，Y為每克試樣上的生物負載（CFU/g）；P為修正系數(shù)；M為3個試樣洗脫2次后的平均CFU。

5 討論

影響產(chǎn)品生物負載水平的因素有很多，總體而言，在進行生物負載測定時，我們應考慮到產(chǎn)品的生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)過程及特性等，為不同的步驟（取樣→微生物采集→移至培養(yǎng)基、培養(yǎng)計數(shù)→確定修正系數(shù)→確定生物負載量）選擇適當?shù)姆椒ā?/p>

本研究通過采用袋蠕動法將產(chǎn)品和一定體積的洗脫液裝在一個無菌均質(zhì)袋內(nèi)，開啟均質(zhì)器，設(shè)定拍擊頻率為6次/s，運行時間為60 s，使洗脫液貫穿樣品的內(nèi)外，最大化、最有效地將產(chǎn)品上的微生物重復洗脫下來，然后采用薄膜過濾法對洗脫液進行過濾后，將濾膜放至適宜的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，并計數(shù)，之后通過修正系數(shù)對計數(shù)結(jié)果進行修訂。本研究方法的關(guān)鍵在于如何最大化、最有效地將微生物洗脫下來，從而確定產(chǎn)品的生物負載，所以，我們需要根據(jù)產(chǎn)品的特性，選擇合適的洗脫液、洗脫速率、洗脫時間。不同的洗脫液、不同的洗脫速率、不同的洗脫時間可能會導致微生物不被檢測到或被破壞而導致其死亡，這些因素會造成微生物總檢出率低、微生物種類丟失等，進而造成生物負載檢測數(shù)據(jù)不準確，直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量控制[6]，因此，合理選擇生物負載指標是確保產(chǎn)品質(zhì)量指標符合產(chǎn)品風險管理要求的重要保證[7]。

由表1～3可知，樣品洗脫2次后，CFU 增加緩慢；由表4可知，樣品洗脫2次后的回收率明顯增高，且回收率均大于80%。產(chǎn)品的回收率越高，生物負載檢測結(jié)果的準確度越高，但是，在實際檢測過程中，不能一味地追求高回收率，還應綜合考慮檢測過程的便捷、高效，因此，本研究結(jié)合醫(yī)用脫脂棉特性及實際檢測過程，最終選擇洗脫2次的平均回收率來確定修正系數(shù)，最后確定生物負載量。在方法未改變的前提下，我們可以利用已得到的修正系數(shù)計算結(jié)果，使檢測方法得到簡化[8]；若回收率低于50%，則應考慮其他改進方法。