張廷奕,王燦,李治衡,汪蓓,付余*,鄔威

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)2(西南大學(xué) 食品科學(xué)與工程國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,重慶,400715) 3(西南大學(xué)附屬中學(xué),重慶,400700)4(西南大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,重慶,400715)

長期的高鈉鹽飲食是心血管疾病的主要誘發(fā)因素之一,而減少鈉鹽攝入可有效降低罹患心血管疾病的風(fēng)險[1]。目前,常使用的食鹽替代物(如KCl、CaCl2或MgCl2)會導(dǎo)致食品的感官品質(zhì)下降,例如風(fēng)味降低、金屬異味增加[2]。因此,如何在減少鈉鹽的同時又不犧牲食品的味道成為亟需解決的問題。

食源性肽是以食源性蛋白為原料,經(jīng)過酶解、分離后的蛋白水解產(chǎn)物,具有良好的營養(yǎng)價值、生理活性以及呈味特性[3]。日本科學(xué)家TADA首次在酪蛋白水解物的N-端類似物合成過程中發(fā)現(xiàn),Orn-β-Ala·HCl和Orn-Tau·HCl具有與NaCl類似的咸味[4]。不同食品蛋白質(zhì)來源的短肽,特別是魚精蛋白[5]、酪蛋白[5]和大黃魚蛋白[6]來源的肽具有一定的咸味增強(qiáng)作用。但是咸味肽的提取與合成費(fèi)用十分昂貴,因此不適合實(shí)際應(yīng)用。多肽與還原糖在加熱的條件下會發(fā)生美拉德反應(yīng),其反應(yīng)產(chǎn)物的滋味顯著提升,主要關(guān)鍵呈味物質(zhì)為分子質(zhì)量1 k～5 kDa的美拉德肽。食源性多肽與還原糖的美拉德反應(yīng)后,少量的美拉德肽可使食物更加美味,同時對人體的咸味受體TRPV1t產(chǎn)生增強(qiáng)作用[7-9]。最新研究表明,大豆蛋白[10]、豬血漿蛋白[11]和火雞肉蛋白[12]來源的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物均有顯著的咸味增強(qiáng)效果。

羅非魚在加工過程中,會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物(如魚皮、魚骨、魚鱗等),約占魚體重的40%～60%。羅非魚魚皮富含膠原,是一種良好的蛋白質(zhì)資源。此外,由于膠原中含有大量的甘氨酸,因此酶解產(chǎn)生的膠原肽不具有苦味。通過蛋白酶水解結(jié)合美拉德反應(yīng)修飾,有望將羅非魚魚皮轉(zhuǎn)化為高附加值的咸味增強(qiáng)肽,同時延伸羅非魚加工產(chǎn)業(yè)鏈。本研究以羅非魚魚皮膠原為原料,通過蛋白酶水解結(jié)合美拉德反應(yīng)修飾制備咸味增強(qiáng)肽,探究不同還原糖種類對所形成的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的理化性質(zhì)以及增咸作用的影響,為制備咸味增強(qiáng)肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚魚皮膠原(蛋白質(zhì)含量85.2%),上海鑫汐生物科技有限公司;食品級D-核糖、D-木糖、葡萄糖、氨基葡萄糖(純度均>99%),深圳一諾食品配料有限公司；食品級蛋白酶A,日本天野酶制品株式會社；食品級NaCl(純度≥99.1%),重慶市北碚區(qū)永輝超市；鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)(純度98%)、N-乙?；?L-半胱氨酸(純度99%)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),北京索萊寶科技有限公司;L-亮氨酸(純度99%),瑞士阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；葡萄糖含量檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所；其他所用試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

F-380熒光分光光度計(jì),天津港東科技發(fā)展股份有限公司；UV-6100紫外分光光度計(jì),上海元析儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋,上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PB-10 pH計(jì),Sartorius賽多利斯；UltraScan PRO全自動多功能色差儀,美國HunterLab。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備

參考FU等[11]的方法。加水調(diào)整底物蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度至50 g/L,調(diào)節(jié)pH至7.0、溫度50 ℃,加入蛋白酶A進(jìn)行水解(水解過程中不調(diào)整pH,以避免引入過多的Na+)。反應(yīng)5 h后,沸水浴滅酶15 min。冷卻至室溫,離心除去沉淀后,獲得膠原肽。按蛋白質(zhì)與還原糖質(zhì)量比5∶1,添加不同還原糖(木糖、核糖、氨基葡萄糖和葡萄糖)于膠原肽中,調(diào)節(jié)pH至7.0,沸水浴反應(yīng)3 h(經(jīng)過前期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,反應(yīng)3 h后的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有最高的咸味增強(qiáng)率,同時反應(yīng)3 h后還原糖已經(jīng)全部消耗),立即冷卻,冷凍干燥后用于后續(xù)分析。選擇未糖基化的膠原肽作為對照組。

1.3.2 pH和色澤變化的測定

利用pH計(jì)測定不同美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的pH值。

采用色差儀來測定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的L*(亮度值)、a*(紅度值)、b*(黃度值),以超純水作為空白組,總色差(ΔE)按公式(1)計(jì)算:

(1)

1.3.3 游離氨基含量測定

采用OPA法測定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中游離氨基含量[13]。OPA試劑由10 mL 50 mmol/L的OPA,10 mL 50 mmol/L的N-乙酰基-L-半胱氨酸,5 mL 200 mg/mL的SDS和75 mL 100 mmol/L硼酸鹽緩沖液(pH 9.5)組成。OPA測定由10 μL樣品(或標(biāo)準(zhǔn)品)與1.2 mL OPA試劑混合,室溫反應(yīng)10 min,通過紫外可見分光光度計(jì)測定其在340 nm波長處的吸光值。使用亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,吸光值轉(zhuǎn)換為亮氨酸質(zhì)量濃度當(dāng)量(μg/mL),按公式(2)計(jì)算：

y=0.000 4x+0.051 3(R2=0.999 2)

(2)

式中：x，亮氨酸質(zhì)量濃度,μg/mL；y，吸光值(A)。

1.3.4 光譜法分析美拉德反應(yīng)產(chǎn)物

1.3.4.1 紫外光譜分析

采用紫外光譜法分析美拉德反應(yīng)的程度。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物用超純水稀釋至5 g/L,利用紫外分光光度計(jì)在波長為200～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.4.2 熒光光譜分析

采用熒光光譜法分析美拉德反應(yīng)的程度。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物用超純水稀釋至5 g/L,借助熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長為347 nm,發(fā)射波長為370～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行熒光光譜掃描。

1.3.5 分子排阻色譜分析美拉德反應(yīng)產(chǎn)物

采用Ultimate 3000高效液相色譜系統(tǒng)分析美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布[14]。色譜柱為Phenomenex BioSepTMSEC-S2000。洗脫液為乙腈/水/三氟乙酸。進(jìn)樣體積10 μL,流速0.5 mL/min,檢測波長214 nm。采用Chromeleon軟件分析色譜數(shù)據(jù),美拉德肽的分子質(zhì)量分布采用標(biāo)準(zhǔn)樣品與洗脫體積擬合方程計(jì)算。采用以下標(biāo)準(zhǔn)Trp(204 Da),GLV(287 Da),SGNIGFPGPK(1 114 Da)、胰島素(5 700 Da)和肌紅蛋白(17 600 Da),獲得分子質(zhì)量校準(zhǔn)曲線,按公式(3)計(jì)算:

lgMW=-0.608 6t+6.938 1

(3)

式中：MW,分子質(zhì)量,Da；t,洗脫時間,min。

1.3.6 美拉德產(chǎn)物的增咸特性評估

1.3.6.1 咸味強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)文獻(xiàn)[15],建立9人感官評價小組,感官評價員均具有2年以上的食品感官評價經(jīng)驗(yàn),對不同還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的增咸作用進(jìn)行評價。首先,小組成員對3位數(shù)隨機(jī)編碼的5種不同濃度NaCl溶液(0.017、0.051、0.085、0.119、0.153 mol/L)進(jìn)行咸味強(qiáng)度評分(0=無,14=極強(qiáng)),進(jìn)而建立評價標(biāo)準(zhǔn)尺度。根據(jù)每位小組成員對各濃度NaCl溶液進(jìn)行評分,得出各濃度溶液咸味強(qiáng)度平均值,繪制NaCl溶液濃度與咸味強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6.2 咸味強(qiáng)度評價

配制不同還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(10 g/L)溶液,加入一定量NaCl,使NaCl終濃度為0.051 mol/L。選擇0.051 mol/L的NaCl溶液為對照,通過感官評價分析不同還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的咸味增強(qiáng)率。樣品采用3位數(shù)隨機(jī)編碼,取15 mL置于黑色品飲杯中,隨機(jī)順序呈送給各評價員,評價其咸味強(qiáng)度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其咸味增強(qiáng)率,按公式(4)計(jì)算：

(4)

式中：x1,0.051 mol/L NaCl溶液咸味強(qiáng)度(5.44)；x2,樣品咸味強(qiáng)度。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。采用SPSS 22.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Pearson相關(guān)性分析,并用Duncan法進(jìn)行事后多重比較(P<0.05代表有顯著性差異,P>0.05代表無顯著性差異)。

2 結(jié)果與分析

2.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的pH和色澤變化

美拉德反應(yīng)過程中會發(fā)生一系列的化學(xué)反應(yīng),引起反應(yīng)產(chǎn)物pH和色澤的變化[16]。不同還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的pH呈不同程度的下降,分別下降至6.23(核糖)、6.35(氨基葡萄糖)、6.69(木糖)和6.95(葡萄糖)。由于美拉德反應(yīng)過程中會產(chǎn)生一些酸性物質(zhì)(乙酸等),同時美拉德反應(yīng)會消耗膠原肽的氨基,進(jìn)而導(dǎo)致反應(yīng)體系的pH下降。

美拉德反應(yīng)高級階段會生成類黑精等褐色物質(zhì),引起反應(yīng)產(chǎn)物色澤的變化。不同還原糖與膠原肽的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的色差值如表1所示。與對照組相比,核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物a*值和L*值變化顯著。不同還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的b*值呈現(xiàn)上升的趨勢,表明美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有明顯的黃色特征。此外,不同還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的總色差(ΔE*)變化趨勢為核糖(14.19)>氨基葡萄糖(5.40)>木糖(3.65)>葡萄糖(0.31),這與pH值變化趨勢一致,其中核糖導(dǎo)致美拉德產(chǎn)物的褐變最強(qiáng)烈,主要由于核糖作為五碳糖,比六碳糖具有更高的反應(yīng)活性[17]。

表1 不同還原糖與膠原肽的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的色差值

4種還原糖對應(yīng)的膠原肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物如圖1所示,該結(jié)果與總色差結(jié)果一致,即核糖顏色最深,而葡萄糖顏色最淺。

圖1 四種還原糖與膠原肽的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的照片

2.2 游離氨基含量變化

在美拉德反應(yīng)過程中,肽的游離氨基與體系中還原糖的羰基發(fā)生反應(yīng),造成氨基的損失[17]。游離氨基含量的減少,可間接地反應(yīng)出美拉德反應(yīng)的程度。圖2結(jié)果表明,與對照組相比,除氨基葡萄糖,其他還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的游離氨基濃度顯著下降(P<0.05),該結(jié)果與JIANG等[18]的結(jié)果一致,即美拉德反應(yīng)后,其反應(yīng)產(chǎn)物的游離氨基含量下降。氨基葡萄糖與膠原肽的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物游離氨基濃度顯著高于對照組(P<0.05),主要是由于其自身含有氨基,造成其反應(yīng)產(chǎn)物樣品濃度高于膠原肽對照組。

圖2 不同還原糖與膠原肽的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的游離氨基含量

在本研究中,其他3種還原糖導(dǎo)致游離氨基下降的順序?yàn)楹颂?木糖>葡萄糖。

2.3 紫外、熒光光譜分析

紫外掃描光譜法可用于監(jiān)測美拉德反應(yīng)的進(jìn)程[19]。320 nm處的吸光值可用于衡量美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的形成,而420 nm處的吸光值常用于衡量美拉德反應(yīng)終末產(chǎn)物(類黑精等)的形成[12]。在本研究中,不同還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的紫外掃描光譜如圖3所示。與對照組相比,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在280～420 nm具有更高的吸光值,其大小順序?yàn)楹颂?氨基葡萄糖>木糖>葡萄糖。核糖和氨基葡萄糖在320和420 nm處具有更高的吸光值,說明他們在美拉德反應(yīng)過程中產(chǎn)生了更多的中間產(chǎn)物和終末產(chǎn)物,該結(jié)果與pH和色澤分析結(jié)果高度相關(guān)。在相同反應(yīng)條件下,五碳糖的反應(yīng)速率大于六碳糖,進(jìn)而形成了更多的美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物和終末產(chǎn)物[20]。核糖作為一種五碳糖,具有極強(qiáng)的反應(yīng)速率。因此,本研究中核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有較高的反應(yīng)程度。

圖3 不同還原糖與膠原肽的美拉德產(chǎn)物紫外吸收光譜圖

熒光掃描光譜法可用于評估美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的小分子熒光產(chǎn)物[12,21]。不同還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光掃描光譜圖見圖4?？傮w而言,與對照組相比,各個反應(yīng)產(chǎn)物在400～550 nm具有更高的熒光強(qiáng)度(最大熒光強(qiáng)度λ=430 nm),說明形成了具有熒光吸收的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。不同還原糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度大小順序?yàn)榘被咸烟?木糖>核糖>葡萄糖。其中,氨基葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有更多的熒光物質(zhì)(與紫外掃描光譜結(jié)果類似),主要是由于形成的美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物具有熒光特性,可以作為褐色類黑精等物質(zhì)前體,所以美拉德體系中熒光強(qiáng)度與紫外光吸收強(qiáng)度表現(xiàn)出不同趨勢[22]。

圖4 不同還原糖與膠原肽的美拉德產(chǎn)物熒光光譜圖

2.4 分子質(zhì)量分布

采用分子排阻色譜分析美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布,結(jié)果如圖5所示。與對照組相比,不同還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布變化不顯著,其中分子質(zhì)量<1 kDa肽組分略有下降,主要?dú)w因于低分子質(zhì)量的小肽具有較高反應(yīng)活性,參與美拉德反應(yīng)后比例降低[11]。1 k～5 kDa的美拉德肽組分比例增加不顯著(P>0.05),可能是由于交聯(lián)反應(yīng)以及分子質(zhì)量>5 kDa的肽組分降解導(dǎo)致。還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的分子質(zhì)量變化不顯著,主要是由于各實(shí)驗(yàn)組中熱降解和交聯(lián)同時發(fā)生,達(dá)到了一個動態(tài)平衡狀態(tài)[22-25]。值得一提的是,分子質(zhì)量為1 k～5 kDa的美拉德肽可以作為風(fēng)味增強(qiáng)物質(zhì),有助于增加食物的咸味強(qiáng)度[9]。FU等[11,14]研究表明,豬肌肉蛋白水解物與氨基葡萄糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布比例與水解物之間無顯著差異。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有更高比例的1 k～5 kDa肽組分,是否能提高其咸味增強(qiáng)特性,需要進(jìn)行感官實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖5 不同還原糖與膠原肽的美拉德產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布

2.5 咸味增強(qiáng)作用評價

根據(jù)不同NaCl溶液濃度與咸味強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=75.49x+1.716 7,R2=0.980 4。將4種還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物加入NaCl溶液后(終質(zhì)量濃度為10 mg/mL),其咸味強(qiáng)度評價結(jié)果見表2?？傮w而言,4種還原糖美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物呈現(xiàn)出不同的增咸效果。木糖、核糖及氨基葡萄糖經(jīng)過美拉德反應(yīng)后均具有一定咸味增強(qiáng)作用,然而不同還原糖間差異不顯著(P>0.05)。與NaCl對照溶液(51 mmol/L)相比,木糖、核糖和氨基葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的咸味增強(qiáng)率分別為8.64%、6.25%和18.01%,其中氨基葡萄糖增咸效果顯著(P<0.05),可能是由于氨基葡萄糖具有較高的反應(yīng)速率。

表2 不同還原糖與膠原肽的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的咸味增強(qiáng)率

在前期實(shí)驗(yàn)中,以葡萄糖為例,測定美拉德反應(yīng)3 h后葡萄糖的消耗量超過91.5%。該結(jié)果表明,在溫度100 ℃、膠原肽與葡萄糖添加質(zhì)量比例為5∶1、反應(yīng)時間3 h,絕大部分葡萄糖被消耗。在相同的美拉德反應(yīng)條件下,4種還原糖的反應(yīng)活性為核糖>氨基葡萄糖>木糖>葡萄糖,考慮到其他3種還原糖比葡萄糖具有更強(qiáng)的反應(yīng)活性,因此在美拉德反應(yīng)過程中完全消耗。此外,本研究美拉德反應(yīng)中蛋白質(zhì)與還原糖質(zhì)量比為5∶1,因此體系中糖含量較低,加之它們的甜度值也較低(核糖沒有甜味)，即使有剩余,對反應(yīng)產(chǎn)物的咸味影響很小。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前研究結(jié)果一致,即不同還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對人咸味受體TRPV1t產(chǎn)生不同增強(qiáng)作用,增咸趨勢為氨基葡萄糖>木糖>葡萄糖[7]。課題組前期研究表明,豬血漿蛋白水解物與氨基葡萄糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物能夠起到一定的增咸作用,其主要原因是反應(yīng)產(chǎn)物中含有咸味增強(qiáng)作用的美拉德肽(1 k～5 kDa),但是其確切的增咸分子機(jī)制尚未闡明。王欣等[26]發(fā)現(xiàn)雙酶酶解哈氏仿對蝦蛋白可將其酶解產(chǎn)物的感官咸味強(qiáng)度從10 mmol/L NaCl 提高至55 mmol/L NaCl。陳瑞霞等[27]研究發(fā)現(xiàn),淘汰蛋雞蛋白酶解物可將50 mmol/L NaCl 溶液的咸味強(qiáng)度提升26.2%。本研究中氨基葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物有望作為咸味增強(qiáng)物質(zhì)在食品領(lǐng)域應(yīng)用,然而其確切的增咸構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

探究核糖、木糖、葡萄糖和氨基葡萄糖對魚皮膠原肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的理化性質(zhì)和咸味增強(qiáng)作用的影響,發(fā)現(xiàn)4種還原糖得到的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有不同的理化特性及增咸作用,其中氨基葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的增咸效果顯著。4種還原糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物pH和游離氨基含量呈下降趨勢,核糖和氨基葡萄糖膠原肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物總色差變化顯著。氨基葡萄糖-膠原肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物形成了大量的中間產(chǎn)物和終末產(chǎn)物。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中1 k～5 kDa肽組分比例增加,主要是形成具有咸味增強(qiáng)作用的美拉德肽。不同美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有不同的咸味增強(qiáng)作用,其趨勢為氨基葡萄糖>木糖>核糖>葡萄糖,其中氨基葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的咸味增強(qiáng)作用最佳,能夠?qū)?1 mmol/L的NaCl溶液的咸味感知強(qiáng)度提高18%。然而,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的構(gòu)效關(guān)系以及確切的增咸機(jī)制有待進(jìn)一步研究。