王旭蘭，張煒，李喆，王亞萍，吳皓宇，王群讓，邢坤，常鳳軍，王英

急性心肌梗死（AMI）是在冠狀動脈（冠脈）發(fā)生狹窄的基礎上因各種誘因（如勞累、情緒波動等）導致斑塊破裂而激活血小板，激活的血小板進一步刺激更多的血栓形成和產(chǎn)生縮血管物質，最終致使冠脈持續(xù)性缺血缺氧和心肌壞死。臨床多表現(xiàn)為劇烈而持續(xù)的胸痛，同時伴血清心肌酶活性增高及心電圖動態(tài)演變，有極高的致死率[1]。循環(huán)微粒（MPs）是機體在各種刺激誘導下由內皮細胞、血小板等血管源細胞釋放的微小顆粒，既往研究發(fā)現(xiàn)MPs與內皮功能損壞密切關系[2,3]。AMI的有效處理方式是冠脈介入治療，但AMI患者行冠脈介入治療時缺血再灌注是其常見并發(fā)癥，缺血再灌注時各種炎癥因子釋放和血小板的激活是否會影響MPs的功能和數(shù)量目前尚未報道。本研究通過比較行冠脈介入治療的穩(wěn)定型心絞痛及AMI患者（發(fā)生缺血再灌注者）的MPs功能及數(shù)量的差異，探討MPs在心肌缺血再灌注中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象本實驗為前瞻性研究，實驗組為2017年2～7月就診于陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院心血管內科的AMI患者30例，年齡40～62（48.62±10.41）歲，排除2型糖尿病、高血壓、腎功能衰竭、嚴重感染性疾病等患者。對照組為同期就診的穩(wěn)定型心絞痛患者30例，年齡42～65（50.79±11.38）歲。所有參與者均簽署知情同意書，本研究通過我院倫理委員會批注。

1.2 MPs提取冠脈介入治療結束時抽兩組患者的冠脈血（實驗組抽取缺血再灌注時冠脈血液），依參考文獻提取MPs：血液標本低溫送至醫(yī)院實驗中心，離心（4℃ 4000 rpm，10 min）后提取上層血漿再次離心（4℃ 11 000 g，2 min），離心后上層血漿為乏血小板血漿。取乏血小板血漿2 ml行最終離心（4℃ 13 000 g，45 min）。最后MPs將沉淀于離心管底部，用RPMI1640培養(yǎng)基（美國，GIBCO公司，100 μl）重新懸浮MPs。BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國，Thermo Scientific 公司）測定MPs濃度后將其存放于4℃冰箱（中國，海爾公司）備用。

1.3 MPs來源檢測按文獻[4]報道采用流式細胞儀檢測MPs來源：取乏血小板血漿50 μl與5 μl anti-CD31-PE抗體和5 μl anti-CD41-FITC抗體（美國，Beckman Coulter公司）在室溫下孵育30 min。孵育結束后取50 μl流量計數(shù)儀珠（美國，Beckman Coulter公司）加入到孵育好的抗體標記MPs中，對樣品進行分析。內皮來源的MPs（EMP）被定義為CD31（+）/（-），血小板來源（PMP）的MPs被定義為CD41 CD31（+）/（+）。

1.4 一氧化氮（NO）檢測6只雄性SD大鼠（180±10 g，本研究通過陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院倫理委員會審核，動物使用批準號：SYXK2016-006），經(jīng)斬頭處死后取胸主動脈放置于預冷并通氣的Kreb’s平衡液（NaCl 119.0 mmol/L，NaHCO325.0 mmol/L glucose 11.1 mmol/L，CaCl21.6 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L和MgSO41.2 mmol/L， PH 7.4）中，小心剔除動脈周圍脂肪組織后縱行剖開血管，將血管放入含有DMEM培養(yǎng)基（美國，GIBCO公司）的6孔板內并置于細胞培養(yǎng)箱內穩(wěn)定1 h，加入等量的兩組MPs孵育血管30 min（空白對照組血管不做任何處理）。用NO檢測試劑盒（中國，南京建成生物科技公司）檢測各組培養(yǎng)基中NO含量，各組血管烘干稱重用于計算單位重量NO含量。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，Graph pad prism5進行作圖。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較兩組除在MPs含量上有差異外，在性別、年齡、血脂、體質指數(shù)等方面比較，均無明顯統(tǒng)計學差異（表1）。

表1 兩組一般臨床資料

2.2 MPs來源檢測與對照組比較， 實驗組MPs中血小板來源（PMP，黃框，46.52%±8.37%）及內皮細胞來源（EMP，綠框，32.81%±6.58%）MPs均增多，其中以PMP增多更為顯著（圖1）。

圖1 MPs來源檢測

2.3 MPs對NO含量的影響與空白組比較，對照組MPs抑制離體血管NO產(chǎn)生；而實驗組MPs較對照組進一步抑制了離體血管NO的產(chǎn)生（圖2）。

圖2 MPs對NO含量的影響

3 討論

本文通過比較AMI患者MPs與穩(wěn)定型心絞痛患者MPs含量與功能發(fā)現(xiàn)，患者行冠脈介入治療發(fā)生缺血再灌注時MPs含量明顯升高，升高的MPs以PMP為主，且明顯抑制離體大鼠胸主動脈NO的產(chǎn)生。

AMI的發(fā)病率隨著我國經(jīng)濟發(fā)展呈上升趨勢，AMI逐漸成為危害我國人民生命健康的重要疾病。研究發(fā)現(xiàn)：血小板激活、炎癥因子活化、內皮功能紊亂在AMI的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。先前研究[6]發(fā)現(xiàn)：MPs不但能抑制內皮型一氧化氮合酶（eNOS）的活化影響血管新生，還能加強高脂血癥對血管新生的抑制作用。李蕓等[2]研究發(fā)現(xiàn)：急性ST段抬高性心肌梗死患者體內MPs水平較正常人升高，且其體內的MPs通過抑制eNOS活化和上調內皮素-1（ET-1）表達導致內皮功能紊亂。Ahn研究[7]顯示：主動脈瓣狹窄致使體內MPs含量升高，而體內升高的MPs通過損害內皮功能反過來加重主動脈瓣膜損傷而形成“惡性循環(huán)”。本研究著眼于MPs與AMI在內皮、血小板上的共性，研究發(fā)現(xiàn)：AMI患者行冠脈介入治療發(fā)生缺血再灌注后致使冠脈內MPs含量升高，升高的MPs多數(shù)來源于血小板激活。

NO含量下降和氧化應激反應的增強是反應內皮功能受損的重要指標。既往研究[8]發(fā)現(xiàn)，冠心病患者MPs可抑制離體大鼠胸主動脈NO的產(chǎn)生和內皮依賴的血管舒張功能。既往研究[3]還顯示：肺動脈高壓大鼠體內MPs含量隨肺高壓病情進展而升高，且升高的MPs通過抑制eNOS活化和促進彈性蛋白表達參與了肺高壓的發(fā)生發(fā)展。缺血再灌注導致冠脈血中升高的MPs對離體大鼠胸主動脈NO的產(chǎn)生有更強的抑制力，闡明了冠脈缺血再灌注時的機理。

綜上所述，缺血再灌注時機體冠脈內內皮及血小板來源的MPs水平升高，升高的MPs抑制了血管產(chǎn)生和釋放NO的能力，MPs的這一作用可能會進一步加重冠脈缺血再灌注，形成惡性循環(huán)。為尋求新的和更有效的預防和緩解缺血再灌注的方法影響提供了理論依據(jù)。