林婷婷，施克儉，金周晟，張裕堅，夏芳芳，劉樂

溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015

布比卡因是一種長效酰胺類局麻藥，因起效較快、作用時間長、麻醉效能較強等優(yōu)點被廣泛應用于臨床，但若誤入血管可誘發(fā)嚴重的心臟毒性，甚至心臟停搏。1998年WEINBERG等[1]發(fā)現(xiàn)脂肪乳劑可增加布比卡因的毒性閾值，隨后大量文獻都證實了脂肪乳劑可解救布比卡因心肌毒性[2-3]，但其機制仍不完全清楚。近幾年來，局麻藥和自噬的關系陸續(xù)被報道：丁卡因可造成Vero腎細胞自噬體的累積和溶酶體損傷[4]，布比卡因可抑制C2c12成肌細胞自噬流造成大量自噬體堆積[5]，而XIONG等[6]發(fā)現(xiàn)局麻藥可增加人成神經細胞瘤SH-SY5Y細胞自噬體清除。但布比卡因是否通過調控自噬造成心肌毒性，脂肪乳劑是否通過調控自噬來解救布比卡因心肌毒性均鮮見報道。因此本研究通過建立布比卡因心肌毒性模型，用脂肪乳劑進行處理，檢測心肌細胞損傷及自噬水平，探討自噬在脂肪乳劑解救布比卡因心肌毒性中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 H9C2心肌細胞株購自上海中科院細胞庫。布比卡因（美國Sigma公司，B5274-5G），20%脂肪乳劑Intralipid（華瑞制藥有限公司，80EL046），胎牛血清（美國Gibco公司，10099-141），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，C11995500BT），CCK8細胞增殖毒性檢測試劑盒（日本DOJINDO公司，CK04），mRFP-GFPLC3雙標腺病毒（上海漢恒生物科技有限公司，HBAP2100001），BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo公司，23227），微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule- associated protein 1 light chain 3，LC3）抗體（美國Novus公司，NB100-2220SS），p62抗體（英國Abcam公司，ab109012），反轉錄cDNA合成試劑盒（美國Thermo公司，K1622），GAPDH、MAP1LC3、p62引物（上海生工生物工程股份有限公司），SYBR PCR試劑盒（日本Takara公司，RR820A）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：大鼠心肌H9C2細胞用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）中培養(yǎng)。當細胞生長面積達到90%左右，PBS清洗培養(yǎng)瓶，0.25%胰蛋白酶消化細胞，離心棄去消化液后用培養(yǎng)基重懸，吹打，制成單細胞懸液。細胞懸液按1:4傳代，取100 μL、2 mL或者3 mL接種于96孔、6孔板或培養(yǎng)瓶中。

1.2.2 實驗分組：用DMSO將布比卡因粉末配成 200 mmol/L的溶液作為存儲液，-20 ℃分裝保存，在使用時用培養(yǎng)基稀釋成1 mmol/L終濃度。20%的脂肪乳劑Intralipid在使用時用培養(yǎng)基稀釋成1%的終濃度。H9C2心肌細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，換成無血清培養(yǎng)基饑餓8～ 10 h后隨機分成空白溶劑組（DMSO組）、1 mmol/L 布比卡因組（Bup組）、1%脂肪乳劑組（Lip組）、1 mmol/L布比卡因聯(lián)用1%脂肪乳劑組（BLp組），各組用相應藥物處理24 h。本實驗布比卡因及脂肪乳劑的選用劑量及處理時間參考團隊前期研究結果[3]。

1.2.3 CCK8檢測細胞增殖抑制率：將細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后用胰蛋白酶消化，離心重懸計數(shù)后，分別取100 μL至96孔板使其細胞數(shù)為5×103個/孔，每組設3個復孔，以100 μL無細胞的培養(yǎng)基做空白對照，待細胞長至70%左右按照實驗分組進行藥物處理，結束后棄去培養(yǎng)基，用PBS 100 μL/孔清洗；按1:10體積比混合CCK8和無血清培養(yǎng)基DMEM，每孔100 μL加入待測孔中，37 ℃，5% CO2孵育4 h；用酶標儀（美國Molecular Devices公司，Plus384）測定450 nm波長吸光度。記錄每塊板的酶標儀OD值。根據(jù)說明書公式計算細胞增殖抑制率。

1.2.4 光鏡下觀察H9C2心肌細胞形態(tài)：藥物處理結束后將各組培養(yǎng)瓶放置光學顯微鏡（日本Olymous公司，BX51）下觀察，在40、100、200三個倍數(shù)下拍照保存圖片。

1.2.5 電鏡下觀察H9C2心肌細胞自噬情況：藥物處理結束后，用細胞刮輕輕刮取細胞移到1.5 mL離心管，低速離心5 min，棄上清液，PBS清洗，離心成團，加入新鮮2.5%戊二醛固定液，4 ℃過夜。取出固定液中心肌細胞，隨后用1%鋨酸固定1 h，緩沖液洗脫殘余鋨酸后，1%醋酸鈾塊染2 h，通過乙醇梯度脫水，純丙酮深度脫水2次，各10 min；包埋液:丙酮=1:1混合后37 ℃烘箱2 h，然后包埋液:丙酮=4:1 37 ℃烘箱過夜。第2天準備好標簽，標記好組織名稱、編號。取出樣品轉移到另一新的 0.5 mL離心管中，加入純包埋液同時將標簽紙貼壁放入離心管中，45 ℃烘箱3 h，65 ℃烘箱48 h。干燥后制作半薄切片和超薄切片，經醋酸鈾-枸櫞酸鉛復染后在透射電鏡下觀察。

1.2.6 mRFP-GFP-LC3雙標腺病毒檢測自噬流：將細胞狀態(tài)良好的H9C2心肌細胞鋪在激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿中，細胞密度為1×105個/mL。貼壁24 h后，加入感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=300左右劑量的mRFP-GFP-LC3轉染H9C2心肌細胞，細胞放入培養(yǎng)箱孵化6 h后更換成新鮮培養(yǎng)基。轉染12 h后按照實驗分組進行藥物處理，結束后棄掉培養(yǎng)基加入5%的多聚甲醛固定10～15 min，之后DAPI染色5～10 min于激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡公司，TCSSP8X）下觀察拍照。RFP用于標記及追蹤LC3，GFP在溶酶體酸性環(huán)境下容易淬滅，因此，GFP指示的綠色熒光斑點是自噬體，RFP指示的紅色熒光斑點是自噬體及自噬溶酶體，兩者合并呈現(xiàn)黃色熒光斑點（即GFP+/RFP+-LC3）表示自噬體，而紅色熒光斑點（即GFP-/RFP+-LC3）指自噬溶酶體。

1.2.7 Western blot檢測LC3II/I和p62蛋白相對表達量：藥物處理結束后，棄去培養(yǎng)基，加入4 ℃預冷PBS清洗，培養(yǎng)細胞總蛋白提取劑及蛋白酶抑制劑（PMSF）（100:1配制）提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度并配置上樣蛋白。SDS-PAGE電泳將目的蛋白轉移至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1 h，之后用兔抗GAPDH（1:1 000）、兔抗LC3（1:1 000）、兔抗p62（1:1 000）等一抗4 ℃水平搖床孵育過夜，次日加入山羊抗兔IgG（H+L）HRP（1: 5 000）室溫孵1 h，后加入ECL發(fā)光液，用凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）自動顯影讀取條帶灰度值，以GAPDH為內參，計算目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值。最后組間數(shù)據(jù)比較時，以DMSO組為對照組，計算其他組與DMSO組的相對值。

1.2.8 RT-PCR檢測MAP1LC3 mRNA和P62 mRNA的表達：藥物處理結束后，TRIzol法提取總RNA，用酶標儀測定RNA的濃度和純度，A260 nm/A280 nm比值為1.8～2.0則認為RNA純度合格。使用反轉錄cDNA合成試劑盒將RNA合成cDNA，管家基因GAPDH的上游引 物序列為5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’，下游引物序列為5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’，MAP1LC3的上游引物序列為5’-CCTTCTTCCTGCTGGTGAAC-3’，下游引物序列為5’-CCGTCTTCATCCTTCTCCTG-3’；P62的上游引物序列為5’-CAAGATGGAGCCGGAGAATA-3’，下游引物序列為5’-CATGGCGTGAGTGAAGGAC-3’。以上述合成的cDNA為模板，按照SYBR PCR試劑盒說明書配制PCR反應體系，將上述反應體系置Bio-Rad熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，95 ℃變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)，熔解曲線為65～95℃，每5 s增加0.5℃。所有目的基因閾值與內參相比較，計算2-ΔΔCT表示基因相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 應用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四組H9C2心肌細胞增殖抑制率比較 DMSO組、Bup組、Lip組、BLp組細胞增殖抑制率分別為0.05±0.04、52.17±5.02，4.34±3.14，16.92± 3.09。與DMSO組比較，Bup組及BLp組的細胞增殖抑制率均顯著增高（P＜0.05）；與Bup組比較，Lip組及BLp組的細胞增殖抑制率均顯著下降（P＜0.05）；與Lip組比較，BLp組的細胞增殖抑制率顯著增高（P＜ 0.05）。

2.2 四組H9C2心肌細胞光鏡下形態(tài)比較 DMSO組細胞形態(tài)長梭型，細胞界限清楚，胞漿無雜質，細胞核清楚；Bup組死亡細胞較多，細胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿雜質多，看不清細胞核；Lip細胞狀態(tài)與DMSO組類似；BLp組與Bup組比較，漂浮死亡細胞大大減少，細胞界限清楚，胞漿清晰，胞核清楚。見圖1。

2.3 四組H9C2心肌細胞電鏡下自噬現(xiàn)象 電鏡下DMSO組未見明顯自噬現(xiàn)象，Bup組可見自噬體堆積，未見自噬溶酶體；Lip組的自噬溶酶體較Bup組多，自噬體較少；BLp組的自噬溶酶體較Bup組多，但比Lip組少。見圖2。

2.4 mRFP-GFP-LC3雙標腺病毒檢測自噬流 Bup組出現(xiàn)自噬體堆積，卻未見自噬溶酶體；Lip組主要是自噬溶酶體，自噬體較少；相比較于Bup組，BLp組自噬體減少，但自噬溶酶體較多。見圖3。

2.5 四組H9C2心肌細胞LC3II/I、p62蛋白表達情況 與DMSO組比較，Bup組及BLp組LC3II/I蛋白表達均顯著增高（P＜0.05）；與Bup組比較，Lip組及BLp組均顯著下降（P＜0.05）。與DMSO組比較，Bup組及BLp組p62蛋白表達均顯著增高（P＜0.05）；與Bup組比較，Lip組及BLp組均顯著下降（P＜0.05）；與Lip組比較，BLp組顯著增高（P＜0.05）。見表1。2.6 四組H9C2心肌細胞MAP1LC3和p62 mRNA表達情況 與DMSO組比較，Bup組、Lip組及BLp組MAP1LC3 mRNA表達均顯著增高（P＜0.05）；與Bup組比較，Lip組及BLp組均顯著下降（P＜0.05）。與DMSO組比較，Bup組p62 mRNA表達顯著增高（P＜0.05）；與Bup組比較，Lip組及BLp組均顯著下降（P＜0.05）；與Lip組比較，BLp組顯著增高（P＜0.05）。見表1。

3 討論

本研究參照團隊前期研究方法[3]建立布比卡因心肌毒性模型，用脂肪乳劑進行處理，用CCK8法檢測細胞增殖抑制率及光鏡下觀察細胞形態(tài)損傷，結果發(fā)現(xiàn)，布比卡因處理后細胞增殖抑制率顯著升高，光鏡下漂浮死亡細胞較多，細胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿雜質多，看不清細胞核，而用脂肪乳劑處理后細胞增殖抑制率顯著下降，漂浮死亡細胞大大減少，細胞界限清楚，胞漿清晰，胞核清楚，說明脂肪乳劑解救布比卡因心肌毒性模型制備成功。

圖1 光鏡下四組H9C2心肌細胞形態(tài)比較

圖2 電鏡下四組H9C2心肌細胞自噬現(xiàn)象

圖3 激光共聚焦顯微鏡下四組H9C2心肌細胞自噬流現(xiàn)象（×400）

表1 四組H9C2心肌細胞LC3、p62蛋白及mRNA表達水平比較（每組n=5，±s）

表1 四組H9C2心肌細胞LC3、p62蛋白及mRNA表達水平比較（每組n=5，±s）

與DMSO組比：aP＜0.05；與Bup組比：bP＜0.05；與Lip組比：cP＜0.05

組別 LC3II/I蛋白 p62蛋白 MAP1LC3 mRNA p62 mRNA DMSO組 1.04±0.19 0.97±0.10 0.94±0.08 1.03±0.08 Bup組 4.36±1.40a 3.77±1.28a 2.12±0.48a 2.87±0.78a Lip組 2.07±0.50b 0.39±0.23b 1.40±0.34ab 0.60±0.12b BLp組 3.08±0.87ab 2.12±0.98abc 1.42±0.14ab 1.44±0.35bc

細胞死亡形式分為細胞壞死、凋亡性程序性細胞死亡和自噬性程序性細胞死亡三種類型[7]。自噬是幾乎所有的真核細胞高度保守的進化過程。在正常情況下細胞自噬水平很低，但在細胞應激條件下，如營養(yǎng)物質消耗或氧化應激時可激活自噬，降解異常蛋白質，回收降解產物氨基酸，供細胞利用以維持細胞存活[8-9]。自噬的激活在心臟疾病中是一把雙刃劍。如在心力衰竭情況下自噬激活，將促進肥厚性心肌病導致心力衰竭的異常蛋白降解，從而拮抗心室肥厚[10]；另一方面，過度的自噬損害正常有功能的蛋白和細胞器，導致心功能不全[11]。而細胞自噬水平的下降又將導致細胞內代謝產物的堆積，最終引發(fā)心肌疾病[12]。總而言之，自噬在心室肥厚疾病[10]、心力衰竭[11]、心臟缺血再灌注[13-14]等過程中都有參與調控。

自噬的一個主要特點是自噬體的形成。ERICSSON[15]首次用透射電鏡技術詳細研究了具有雙膜結構包裹著受損的細胞器或者異常蛋白質等的自噬體。LC3在翻譯后加工成水溶性胞漿形式的LC3I，LC3I與磷脂酰乙醇胺綴合形成脂溶性膜型的LC3II，其被招募定位在自噬體膜，故LC3的轉化（LC3II/I）或LC3II的水平被廣泛認可用作自噬體的量化標志物[16]。本研究結果顯示布比卡因處理后電鏡下出現(xiàn)了大量雙膜結構的自噬體，LC3II/I蛋白及基因表達明顯增高，而用脂肪乳劑處理后電鏡下自噬體數(shù)量及LC3II/I蛋白表達均有所減少。上述結果表明布比卡因可造成自噬體的堆積，而聯(lián)用脂肪乳劑處理可改善這一現(xiàn)象。

自噬在細胞內是一個動態(tài)過程，涉及自噬體生成和清除兩個階段，因此布比卡因造成心肌細胞自噬體的堆積表明自噬體生成增加或自噬體清除減少。為進一步探討自噬在脂肪乳劑解救布比卡因心肌毒性中的作用，本研究采用了mRFP-GFP-LC3雙標腺病毒來監(jiān)測自噬體轉化為自噬溶酶體的動態(tài)過程（自噬流），結果顯示布比卡因處理后出現(xiàn)大量黃色熒光斑點，卻未見紅色熒光斑點，而聯(lián)用脂肪乳劑處理后黃色熒光斑點減少，出現(xiàn)紅色熒光斑點，說明布比卡因主要通過抑制自噬體清除造成自噬體的堆積，而脂肪乳劑可激活自噬流加快自噬體清除。

p62是自噬的特異性底物，通過與LC3直接結合從而定位于自噬體中，參與自噬體選擇性的清除過程，因此可通過檢測p62蛋白的表達來評估自噬體清除情況[5，14]。本研究結果顯示，布比卡因處理后p62蛋白及mRNA表達均明顯增加，這結果與LI等[5]的報道類似，而聯(lián)用脂肪乳劑可下調p62的表達，進一步說明布比卡因造成自噬體清除障礙導致自噬體堆積，而脂肪乳劑促進了自噬體的清除。

綜上所述，脂肪乳劑解救布比卡因心肌毒性，其機制與通過激活自噬流從而加快堆積自噬體的清除有關。