柳福智，張迎芳，陳垣

（甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，甘肅蘭州730070）

隨著工業(yè)的發(fā)展，鹽堿化的土壤面積不斷增加。鹽堿化導致土壤鹽堿組分不斷積累［1］，鹽堿組分超標對植物生長具有嚴重的抑制作用，會阻礙植物根系的生長，進而導致植株無法正常生長［2］。植物適應鹽堿脅迫需要植物體內(nèi)各種生理生化反應共同調(diào)控［3］，是一個非常漫長的過程。

甘草（Glycyrrhiza uralensis）是我國的大宗藥材，有“國老”之美譽［4］?！侗静菥V目》有言［5］：“諸藥中甘草為君，治七十二種乳石毒，解一千二百草木毒，調(diào)和諸藥有功?！痹谖覈?，甘草大部分生長在內(nèi)蒙、寧夏、甘肅和新疆等地［6］，甘肅甘草的主產(chǎn)區(qū)位于河西走廊地區(qū)。甘草具有生命力旺盛的根系，對鹽堿組分有一定的抗性。在長期的演進過程中，演變成了對逆境條件的順應激勵機制，可以在各種不利條件下生長，成為干旱半干旱地域的重要植物資源之一［7］。甘草除了具備極廣泛的藥用價值外，還具備極高的生態(tài)價值，是防治風沙、水土流失的重要植物［8］。

海藻糖是一種可溶性非還原性糖，大量存在于低等植物、真菌和一些無脊椎動物體內(nèi)［9］。一些生物體抵抗和忍受惡劣外部環(huán)境的能力與它們體內(nèi)的海藻糖直接相關［10］，海藻糖有抗應激作用和顯著的抗脫水功能，可以維持蛋白質(zhì)結構的穩(wěn)定性，保持細胞膜的完整性［11］，有很強的非特異性保護功能。研究發(fā)現(xiàn)，小麥（Triticum aestivum）幼苗在高溫脅迫下，外源施加適當濃度的海藻糖可增強小麥幼苗內(nèi)抗氧化物保護酶活性［12］，外源海藻糖可以增加低氮脅迫下烤煙（Nicotiana tabacum）葉片的葉綠素含量［13］，降低鹽脅迫下小麥幼苗的脯氨酸（proline，Pro）含量，提高根系活力［14］，在高鹽脅迫下外施海藻糖可以通過維持K+/Na+動態(tài)平衡，降低擬南芥中Na+的含量，減輕K+的損失，使得植株的抗鹽性有所提高［15］。大量試驗結果表明，生物體處于鹽害［14?15］、低溫［16?17］、干旱［18］和重金屬超標［19］等惡劣環(huán)境下，施加適宜濃度外源海藻糖可以增強植株對逆境條件的耐受力和適應力。然而關于外源海藻糖在NaHCO3脅迫下調(diào)控甘草幼苗生長的報道較少。為此，本研究采用甘草無菌苗為試驗材料，探討外源海藻糖對NaHCO3脅迫下甘草幼苗的生長量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量、抗氧化保護酶的活性和甘草總黃酮含量的影響，優(yōu)選能緩解堿脅迫下甘草幼苗生長的最適海藻糖濃度，為在鹽堿地發(fā)展高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)甘草產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

本試驗于2019 年3?8 月在甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)科樓中草藥實驗室進行，甘草種子產(chǎn)自甘肅酒泉，以甘草無菌苗的葉片和根系為供試材料。

挑選適量顆粒飽滿、大小均勻的種子，加98%的濃硫酸攪拌加工35 min，無菌蒸餾水清洗5～6 次，76%乙醇浸潤1 min，清洗4 次，用0.1%升汞在超凈工作臺上進行8 min 浸泡消毒，然后用無菌蒸餾水反復清洗至液體變澄清，最后用殺菌消毒的濾紙擦拭甘草種子，以每瓶8 粒種子接種到高壓滅菌的MS 培養(yǎng)基（含大量元素N、P、K 和Ca 以及微量元素 I、B、Mn、Mo、Cu、Co 和 Fe），置培養(yǎng)室的培養(yǎng)架上。在光照時長為 12～14 h·d?1、溫度為（24±2）℃、濕度為30%～50%的培養(yǎng)室中，使甘草種子發(fā)芽生長，待其生長至10、20 和30 d 時，分別測定幼苗葉綠素、丙二醛、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性及甘草總黃酮含量，測定生長至20 d 的幼苗生長量。試驗共7 個處理：1）CK1（MS 營養(yǎng)液）；2）CK2（0 mmol·L?1海藻糖+50mmol·L?1NaHCO3+MS 營養(yǎng)液）；3）T1（5 mmol·L?1海藻糖+50 mmol·L?1NaHCO3+MS 營養(yǎng)液）；4）T2（10 mmol·L?1海藻糖+50 mmol·L?1NaHCO3+MS 營養(yǎng)液）；5）T3（15 mmol·L?1海藻糖+50 mmol·L?1NaHCO3+MS 營養(yǎng)液）；6）T4（20 mmol·L?1海藻糖+50 mmol·L?1NaHCO3+MS 營養(yǎng)液）；7）T5（25 mmol·L?1海藻糖+50 mmol·L?1NaHCO3+MS 營養(yǎng)液）。每個處理重復 3 次。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 甘草幼苗生長量的測定 用無菌濾紙擦拭供試幼苗表面附著的培養(yǎng)基，分離幼苗的地上和地下部分，分別測量其長度、稱其鮮重。

1.2.2 葉綠體色素含量的測定［20］采用丙酮法進行葉綠體色素提取，用分光光度法進行葉綠體色素含量的測定。

1.2.3 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定［20］采用硫代巴比妥酸法進行測定。

1.2.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測定 用水浴法進行可溶性糖的提取，用蒽酮法測定其含量［20］；用磺基水楊酸法進行脯氨酸提取，用水合茚三酮法測定其含量［21］。采用火焰光度法進行Na+和K+濃度的測定［22］。

1.2.5 抗氧化酶活性的測定 用冰浴研磨、冷凍離心法進行抗氧化酶液的提取。采用NBT 光化還原法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性［23］；愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性［23］；用紫外吸收法測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性［24］。

1.2.6 總黃酮含量的測定 采用超聲法［25］進行提取，用紫外分光光度法對甘草幼苗的總黃酮含量進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，Excel 2010 軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖，用LSD 法進行方差分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗生物量的影響

表1 是甘草幼苗生長至20 d 所測的生物量，由此可知，CK2處理長勢最弱，T3處理相對于其他6 個處理長勢較好。NaHCO3脅迫顯著抑制了甘草幼苗的生長，加入外源海藻糖后甘草幼苗生長受抑制作用減弱。與CK1處理相比，CK2處理根長、株高、根系鮮重和全重分別減少了18.88%、23.06%、31.25%和15.70%。梯度濃度外源海藻糖的施加，對甘草幼苗的生物量產(chǎn)生了正面影響，同一時期T1、T2、T3、T4、T5處理與CK2處理相比，根長分別增長了 24.52%、26.44%、29.73%、25.07% 和 20.00%，株高分別增長 27.25%、37.74%、55.14%、29.35% 和22.22%，根系鮮重分別增加了13.63%、29.54%、52.27%、38.63% 和6.81%，全株鮮重分別增加了6.21%、11.72%、19.31%、5.51%和1.38%，綜上所知，T3處理最佳。

表1 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗生物量的影響Table 1 Effects of trehalose at different concentrations on the biomass of licorice seedlings under NaHCO3 stress

2.2 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗葉片中葉綠體色素含量的影響

圖1 表明，隨著生長天數(shù)的改變甘草幼苗葉片的葉綠素不斷積累，NaHCO3脅迫（CK2）處理下甘草幼苗葉片的葉綠素含量均較CK1處理低，生長10、20 和30 d 后，分別較CK1處理減少了52.22%、49.95%、50.93%，與CK1處理均達到顯著性差異，說明在NaHCO3脅迫下葉綠素部分被降解；施加不同濃度海藻糖的各處理中葉綠素含量均高于CK2處理，且與其差異顯著，其中15 mmol·L?1的海藻糖濃度處理最佳，不同時期，分別較CK2處理增加101.21%、93.52%和92.33%，表明適宜濃度的外源海藻糖能提高NaHCO3脅迫下甘草幼苗葉片葉綠素含量。

圖1 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗葉綠素含量的影響Fig. 1 Effects of trehalose concentration on chlorophyll content in licorice seedlings under NaHCO3 stress

2.3 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗丙二醛（MDA）含量的影響

MDA 的積累對植物細胞膜和細胞會造成一定的傷害 ，由圖 2 可知 ，甘草 幼苗生長 10、20 和 30 d 后，NaHCO3脅迫下，甘草幼苗的MDA 含量顯著高于CK1，分別升高34.38%、28.95%和29.27%，施加不同濃度海藻糖后，MDA 含量變化呈先下降再上升的趨勢，T3處理的MDA 含量達到最低值，較CK2處理分別減少了23.26%、18.37%和14.15%。表明NaHCO3脅迫使得甘草幼苗細胞膜受到損傷，施加外源海藻糖能減輕NaHCO3脅迫對甘草幼苗造成的傷害。

圖2 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗MDA 含量的影響Fig. 2 Effects of trehalose at different concentrations on MDA content of licorice seedlings under NaHCO3 stress

2.4 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

圖3 顯示外源海藻糖對NaHCO3脅迫下甘草幼苗中可溶性糖含量的變化，結果表明，在NaHCO3脅迫下，不同生長天數(shù)甘草幼苗內(nèi)的可溶性糖含量相比空白對照顯著增加，生長 10、20、30 d 后，分別增加了44.79%、32.80%和25.31%，當外源海藻糖濃度增加到 15 mmol·L?1時，即 T3處理，甘草幼苗生長 10、20、30 d 后可溶性糖含量與CK1處理相近，分別較CK2減少34.53%、20.48% 和19.21%，說明外源海藻糖對NaHCO3脅迫條件下的甘草幼苗具有緩解效應。

圖3 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗中可溶性糖含量的影響Fig. 3 Effects of trehalose at different concentrations on soluble sugar content in licorice seedlings under NaHCO3 stress

由圖4 可知，NaHCO3脅迫下甘草幼苗中Pro 含量較 CK1處 理 增 加 ，生 長 10、20、30 d 后 ，分 別 增 加100.28%、82.01%和106.51%，NaHCO3脅迫下施加不同濃度海藻糖后，甘草幼苗中Pro 含量下降，T3處理達到最低水平，隨著天數(shù)增加，T3處理分別較CK2處理降低61.24%、42.73%和51.01%，且生長到10、20和30 d 時均達到顯著水平。

圖4 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗中Pro 含量的影響Fig. 4 Effects of trehalose at different concentrations on Pro content of licorice seedlings under NaHCO3 stress

由圖5 可知，NaHCO3脅迫下甘草幼苗中Na+濃度顯著增加，K+濃度和K+/Na+顯著降低，不同生長天數(shù)CK2處理的 Na+濃度為 CK1處理的 1.5～2.0 倍，K+濃度和 K+/Na+較 CK1處理分別降低 40%～50% 和71%～73%，表明外源海藻糖可顯著降低NaHCO3脅迫下Na+濃度，提高K+濃度，進而提高甘草幼苗中K+/Na+。

圖5 NaHCO3 脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗中Na+濃度、K+濃度和 K+/Na+的影響Fig. 5 Effects of trehalose at different concentrations on Na+concentration，K+ concentration and K+/Na+ in licorice seedlings under NaHCO3 stress

2.5 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對抗氧化酶活性的影響

由圖6 可知，NaHCO3脅迫下甘草幼苗中SOD、POD 和CAT 活性均低于對照，與對照相比，甘草幼苗生長10、20 和 30 d 后，SOD 活性與對照處理相比分別降低了21.91%、31.33%和21.77%，POD 活性分別降低了21.91%、35.89%和29.63%，CAT 活性分別降低了7.49%、8.56%和6.01%。用不同濃度海藻糖處理后 SOD、POD、CAT 活性均顯著升高，T3處理達到最佳水平。隨著生長天數(shù)增加，T3處理與CK2處理相比 ，SOD 活 性 分 別 升 高 112.28%、117.16% 和33.67%，POD 活性分別升高 105.88%、113.76% 和56.98%，CAT 活性 分別升高 50.03%、47.97% 和41.13% 。表明外源海藻糖可通過提高抗氧化保護酶活性而緩解NaHCO3脅迫對甘草生長造成的傷害。

圖6 NaHCO3 脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗中SOD、POD、CAT 活性的影響Fig.6 Effects of trehalose at different concentrations on SOD，POD，CAT activity in licorice seedlings under NaHCO3 stress

2.6 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗中總黃酮含量的影響

由圖7 可知，隨著生長天數(shù)增加，甘草幼苗中總黃酮含量不斷積累，NaHCO3脅迫下甘草幼苗中總黃酮含量顯著降低，甘草幼苗生長10、20 和30 d 時，CK2較CK1處理分別減少了72.94%、64.58%和62.66%。施加不同濃度外源海藻糖后，甘草幼苗中總黃酮含量先快速上升后緩慢降低，T3處理比CK1處理稍低，較其他處理顯著升高，隨著生長天數(shù)增加，較CK2處理分別升高2.43、1.48 和 1.56 倍 。

圖7 NaHCO3脅迫下不同濃度海藻糖對甘草幼苗中總黃酮含量的影響Fig. 7 Effects of different concentrations of trehalose on total flavonoid content in licorice seedlings under NaHCO3 stress

3 討論

生物量是植物對鹽堿脅迫反應的綜合體現(xiàn)，也是評估植物對堿脅迫抗性的直接指標［26］。鹽堿組分是抑制植物生長最常見、最主要的非生物因子［27］。已有大量研究表明，堿脅迫可顯著降低燕麥（Avena sativa）幼苗和紅花（Carthamus tinctorius）幼苗的生物量［28?29］。本研究中，由于在 50 mmol·L?1NaHCO3脅迫下Na+含量過高，致使甘草幼苗嚴重失水，與甘草幼苗生長所需的其他礦質(zhì)元素產(chǎn)生拮抗作用，影響幼苗對必須礦質(zhì)元素的吸收，抑制了甘草幼苗的生長，甘草幼苗的生物量（根長、株高、地上部分的鮮重和幼苗全重）均顯著降低。施加外源海藻糖降低了甘草幼苗中Na+的積累，甘草幼苗的生長量有不同幅度的提高，其中15 mmol·L?1的海藻糖增幅最大，為最佳處理濃度，表明施加適宜濃度海藻糖能夠緩解NaHCO3脅迫對甘草幼苗生長的抑制作用。

葉綠體色素是綠色植物進行光合作用的物質(zhì)基礎，其含量的高低決定了光合作用的強弱［30］。在本研究中NaHCO3脅迫下葉綠體膜受損，妨礙葉綠體色素的合成，甘草幼苗葉片中葉綠素含量顯著降低，施加梯度濃度外源海藻糖后葉綠素含量呈倒V 形變化，可能與海藻糖能夠一定程度清除植物體內(nèi)活性氧有關，從而保護甘草幼苗葉綠體膜的穩(wěn)定性。

鹽堿脅迫會引起植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，發(fā)生膜脂過氧化反應，導致膜脂過氧化產(chǎn)物MDA 積累，其含量高低可以作為植物膜脂受損傷程度的衡量指標［31］。有研究表明，鹽堿脅迫下，施加適宜濃度海藻糖可降低玉米（Zea mays）幼苗［27］和月見草（Oenothera biennis）［32］的 MDA 含量，本研究結果與之一致，NaHCO3脅迫導致甘草幼苗中自由基積累，引發(fā)膜脂過氧化作用，甘草幼苗中MDA 含量顯著增加，施加15 mmol·L?1外源海藻糖后，MAD含量降到最低，減輕了MDA 對細胞膜的傷害，可能與海藻糖具有很強的抗脫水能力，可以在NaHCO3脅迫下保護生物膜免受傷害有關［33］。

NaHCO3脅迫下，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如Pro、Na+、K+和可溶性糖等，可以調(diào)節(jié)細胞的滲透勢，不會造成細胞嚴重失水，使生物大分子的功能和結構保持穩(wěn)定［34］。劉建新等［35］研究發(fā)現(xiàn)，施加外源過氧化氫后降低了堿脅迫下燕麥幼苗中Pro 含量和可溶性糖含量。本試驗結果與之相似，50 mmol·L?1NaHCO3脅迫下甘草幼苗細胞吸水困難，造成甘草幼苗生理干旱，促進甘草幼苗中Pro 和可溶性糖的積累，其含量的增加可以提高甘草幼苗對NaHCO3脅迫的抵抗能力，施加15 mmol·L?1外源海藻糖甘草幼苗中Pro 和可溶性糖含量顯著降低。Na+和K+的代謝具有重要意義，是生物體緩解堿脅迫帶來嚴重危害的生理基礎［36］。本研究與趙瑩等［37］的研究結果一致，NaHCO3脅迫下施加外源海藻糖可以降低Na+濃度，升高K+濃度和K+/Na+，達到維持K+/Na+動態(tài)平衡的目的，從而可以增加細胞質(zhì)濃度，調(diào)節(jié)細胞滲透勢，減輕NaHCO3脅迫對甘草幼苗的傷害。海藻糖濃度超過15 mmol·L?1后，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對NaHCO3脅迫的緩解作用有所減弱，可能是由于海藻糖濃度過高，鑲嵌在甘草幼苗細胞磷脂雙分子層上的各種酶結構有所破壞，導致細胞膜受損。

抗氧化保護酶活性的高低與植物耐鹽堿的程度有關，可以在一定程度上指示植物遭受脅迫的程度［38］。抗氧化保護酶體系主要組成成分有SOD、POD 和CAT 等，它們使植物體內(nèi)的活性氧代謝處于動態(tài)平衡，從而抵御活性氧自由基對細胞的毒害［39］。研究發(fā)現(xiàn)，堿脅迫下黑麥草（Loliumspp.）［40］中 SOD、CAT 和 POD 活性顯著降低，本研究結果與其一致，15 mmol·L?1海藻糖處理后，SOD、POD 和 CAT 活性顯著增強，POD 可以清除甘草幼苗在NaHCO3脅迫下產(chǎn)生的過多的活性氧，CAT 和POD 可以清除在清除活性氧后所產(chǎn)生的其他自由基，維持了甘草幼苗細胞膜的穩(wěn)定性和完整性，減輕活性氧對植物造成的傷害，提高甘草幼苗的耐堿性。以此推測，海藻糖提高堿脅迫下甘草幼苗中抗氧化保護酶活性可能與誘導SOD 基因表達有關。

甘草總黃酮目前在美容化妝品中應用極為廣泛，因為甘草總黃酮可以抑制絡氨酸酶活性、清除氧自由基、抗炎、抗變態(tài)，因此可以起到美白褪斑作用。本研究表明NaHCO3脅迫對甘草幼苗中總黃酮含量的積累有很強的抑制作用，15 mmol·L?1海藻糖對這種抑制作用的緩解效果極顯著。

4 結論

50 mmol·L?1NaHCO3脅迫對甘草幼苗的生長具有明顯的抑制作用，一定濃度的外源海藻糖可以緩解甘草幼苗生長受到的抑制，15 mmol·L?1海藻糖緩解效果最佳。15 mmol·L?1外源海藻糖能夠顯著提高NaHCO3脅迫下甘草幼苗的生長量，增加甘草幼苗葉片中的葉綠素含量，提高光合產(chǎn)量，有效調(diào)節(jié)甘草幼苗細胞的滲透勢，高效提高抗氧化保護酶活性，維持甘草幼苗生長系統(tǒng)的完整性，還能顯著提高甘草黃酮的含量，進而提升甘草的商用價值。