李雪萍 ，劉梅金 ，許世洋 ，郭建煒 ，漆永紅 ，李敏權(quán) *

（1. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，甘肅蘭州730070；2. 甘肅省甘南州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，甘肅合作747000；3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

青稞（Hordeum vulgarevar.nudum）是多棱裸粒大麥統(tǒng)稱，在我國主要種植于西藏、青海、云南、甘肅、四川等省區(qū)海拔較高的地區(qū)，其成熟期短、耐寒性強，在海拔超過4200 m 的高寒地區(qū)，青稞是唯一能夠正常成熟的谷物，因此，在古埃及和我國的藏區(qū)也常被當(dāng)?shù)鼐用褡鳛橹魇常?］。同時，青稞在澳大利亞、歐洲馬其頓、美國北部大平原、加拿大西部等多個國家地區(qū)及我國多個地區(qū)常被作為飼用作物，其富含多種氨基酸、膳食纖維、維生素、β?葡聚糖以及鈣、鎂、磷、鋅、錳、硒等礦質(zhì)元素，亦常被用來釀酒及現(xiàn)代健康食品的加工等［2］。由此可見，青稞的生產(chǎn)不僅保障了高原地區(qū)畜牧業(yè)的發(fā)展及當(dāng)?shù)鼐用竦幕旧睿鼮楝F(xiàn)代人民健康生活水平的提升做出了貢獻。

然而，植物病害嚴(yán)重影響了包括青稞在內(nèi)的大麥類作物的生產(chǎn)。據(jù)Murray 等［3］報道，澳大利亞在1998?2007 年這10 年間，由植物病害造成大麥（Hordeum vulgare）損失每年達2.52 億美元，是總產(chǎn)值的19.6%。在美國北達科他地區(qū)及加拿大，根腐病造成大麥減產(chǎn)近10%［4］。青稞感染根腐病后根和芽的鮮重、干重、谷粒數(shù)均大幅下降，從而導(dǎo)致總產(chǎn)量降低；分析其營養(yǎng)成分發(fā)現(xiàn)，其總碳水化合物下降23.28%～82.77%，蛋白質(zhì)下降0.55%～76.62%，脂肪下降28.45%～79.25%［5］。目前，對大麥類作物病害的研究主要集中在大麥條紋?。??7］、銹病等［8?9］方面，對于根腐病的研究較少，對青稞根腐病的研究僅有本課題組報道［10?11］，而根腐病病害類型復(fù)雜，病原多樣，因寄主、環(huán)境、氣候、土壤等各種因素而異。鑒于此，本研究對西北青藏高原地區(qū)的青稞根腐病進行了調(diào)查，明確其危害程度及發(fā)病癥狀，并采集樣品進行病原分離鑒定、致病性測定，以期為青稞根腐病的防控及致病機理的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查研究區(qū)概況

調(diào)查研究區(qū)選擇甘肅省甘南藏族自治州合作市、卓尼縣、臨潭縣以及青海省海北藏族自治州剛察縣、海東市互助土族自治縣等我國重要的青稞生產(chǎn)區(qū)。其位于青藏高原東部及北部邊緣，平均海拔2800 m 以上，無霜期短，日照時間時長，是典型的大陸性氣候，青稞是該地區(qū)適生作物，也是該地區(qū)最主要的糧飼作物。

1.2 調(diào)查采樣

參考《植病研究法》［12］對該區(qū)域青稞發(fā)病率進行調(diào)查統(tǒng)計，避開地邊5 m，挑選植株枯黃或長勢明顯很弱，且發(fā)病植物地下部普遍有根腐癥狀的地塊，統(tǒng)計其占總地塊的面積比例，即其發(fā)病率，據(jù)此計算同一地區(qū)所有地塊的平均發(fā)病率，即該地區(qū)青稞普通根腐的發(fā)生率；采用多點采樣法采集發(fā)病特征典型的疑似青稞普通根腐病植株，低溫運輸至實驗室進行研究。

1.3 病原的分離與純化

刷掉青稞病株根部土壤，清洗干凈并自然風(fēng)干。從根部的病健交界處剪下根段，70%的酒精消毒2～3 s 并用無菌水沖洗干凈，放入0.1%的升汞溶液中消毒10 s，再用無菌水洗4 次，用無菌濾紙吸干表面水分；然后用無菌解剖刀切去根段兩端，將中間的根段接于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA；培養(yǎng)基成分：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL）平板之上；約3～4 d 后，將根段的兩端長出的菌絲轉(zhuǎn)移到另一PDA 平板之上，并采用單孢分離法［13］對其進行純化。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態(tài)鑒定 觀察并記錄菌株在PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征，在顯微鏡下觀察其菌絲及孢子形態(tài)，參照《真菌鑒定手冊》［14］、《中國真菌志》第十六卷（鏈格孢屬）［15］、第三十卷《蠕形分生孢子真菌》［16］，確定其分類地位。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 將待鑒定菌株活化后接于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，120 r·min?1、25 ℃搖床培養(yǎng)5 d，收集菌絲體，F(xiàn)ungal DNA Kit 試劑盒（OMEGA）提取DNA（操作步驟依據(jù)試劑盒說明書）。選用ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS2（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）引物進行 PCR 擴增。反應(yīng)體系為：總體積 25 μL、基因組 DNA 1.0 μL、10×Buffer（含 2.5 mmol·L?1Mg2+）2.5 μL、Taq 聚合酶（5 U·μL?1）0.5 μL、dNTP（10 mmol·L?1）1.0 μL、Primer（±10 μmmol·L?1）1 μL、ddH2O 補至 25 μL。PCR 參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 80 s，重復(fù)擴增35 個循環(huán)，72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。反應(yīng)完成后，取2 μL PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后委托北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進行測序。得到測序結(jié)果后在NCBI 中進行Blast 比對并選取參考序列，利用MEGA 7.0 中的最大似然法（1000次重復(fù)）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類地位，并將結(jié)果提交至GenBank，獲得登錄號。

1.5 致病性測定

根據(jù)前期研究結(jié)果，燒杯水瓊脂法可以較好、較便捷的反應(yīng)菌株的致病性［13］，具體為：1）將待測菌株活化后接種于1.2%的水瓊脂（water agar，WA）培養(yǎng)基上，置于25 ℃培養(yǎng)3 d。2）將供試種子（品種為藏青2000，由甘南州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供）消毒后25 ℃催芽48 h。3）挑取發(fā)芽一致的種子均勻擺放在帶菌的WA 培養(yǎng)基上，并在不接菌的WA 培養(yǎng)基上接入種子作為對照，每杯放入10 粒，錫紙封口后放入人工氣候箱（兩個階段：第一階段為時間8 h，光80%，濕度60%，溫度25 ℃；第二階段為時間16 h，光照為0，濕度80%，溫度20 ℃）。待種苗長至燒杯口處時揭去錫紙，打開紙盒蓋，繼續(xù)在人工氣候箱中培養(yǎng)，8 d 后觀察發(fā)病情況，參考田間發(fā)病情況及發(fā)病癥狀，確定分級標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計病級，計算其發(fā)病率及病情指數(shù)。

分級標(biāo)準(zhǔn)：0 級?健康無病，葉綠，根與根莖白；1 級?根系有褐色斑點出現(xiàn)，但不超過30%；2 級?根系成段變褐，但不斷裂，不超過30%；3 級?根系成段變褐甚至變黑，容易斷裂，不超過50%；4 級?根系成段變褐甚至變黑，斷裂腐爛，大于50% 或整個植株死亡。

將致病性測定后病株每菌隨機挑出3 株，剪下其種子或病根，接種于PDA 培養(yǎng)基上，于25 ℃下培養(yǎng)7 d 后鏡檢觀察其孢子形態(tài)，在此期間不斷觀察其菌落形態(tài)，確認(rèn)是否與接入時的菌株一致。

1.6 數(shù)據(jù)分析

相關(guān)數(shù)據(jù)整理及分析采用Excel 2007 和DPS 15.10 完成，采用Duncan 新復(fù)極差法進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)生分布

青稞普通根腐病主要分布在甘肅省甘南藏族自治州臨潭縣古戰(zhàn)鄉(xiāng)，卓尼縣柳林鎮(zhèn)、阿子灘鄉(xiāng)、完冒鄉(xiāng)，合作市卡加曼鄉(xiāng)以及青海省海北藏族自治州剛察縣，海東市互助土族自治縣林川鄉(xiāng)。發(fā)生較為普遍，田間發(fā)病率為5%～15%（表1）。

表1 青稞根腐病的調(diào)查Table 1 Investigation on root rot of qinke barley

2.2 發(fā)病癥狀

青稞苗期普通根腐病不易識別，其癥狀為地上葉片多表現(xiàn)為葉色淡，呈黃綠色，幼苗瘦弱或死亡，有明顯的發(fā)病中心，挖出洗凈后可發(fā)現(xiàn)其根部發(fā)黑，容易斷裂或腐爛；青稞成株期普通根腐病多表現(xiàn)為穗白粒癟，莖稈甚至葉片呈黑褐色，挖出洗凈后亦可發(fā)現(xiàn)根部黑褐?jǐn)嗔鸦蚋癄€（圖1）。

圖1 青稞普通根腐病癥狀Fig.1 Qingke barley common root rot symptoms

2.3 病原鑒定

2.3.1 形態(tài)特征 共分離得到13 株青稞普通根腐病病原，其中8 株在PDA 培養(yǎng)基上均呈現(xiàn)青灰褐色，氣生菌絲發(fā)達，厚絨狀，易產(chǎn)生大量分生孢子，孢子呈淡黃褐色至灰褐色，易從兩端萌發(fā)，擬紡錘形，多數(shù)較直，少數(shù)彎曲，平均大小為（63.62～79.36）μm×（18.99～22.46）μm（圖2），初步鑒定為麥根腐平臍蠕孢（Bipolaris sorokiniana）。

圖2 麥根腐平臍蠕孢的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of B. sorokiniana

其中5 株菌落呈青灰褐色，菌絲發(fā)達，在PDA 培養(yǎng)基上容易產(chǎn)生大量的分生孢子，分生孢子黃褐色至青灰褐色，形狀大小不一，有橫隔膜，斜隔膜和縱隔膜，平均大小為（24.86～41.66）μm×（8.32～13.92）μm（圖3）。初步鑒定為鏈格孢（Alternaria alternata）。

圖3 鏈格孢的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of A. alternate

2.3.2 分子鑒定 如圖4 所示，以木賊鐮孢及鏈格孢等作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，D26-2、D23-1、D22-1、D13-1、D32-6、D28-3、NQ4-3、Q7-6 這 8 株菌與麥根腐平臍蠕孢聚為一類，遺傳距離為 0，自展支持值為 100（1000 次重復(fù)）。結(jié)合形態(tài)特征鑒定的結(jié)果，確定本研究分離到的此8 株菌均為麥根腐平臍蠕孢。提交序列至GenBank，獲得的登錄號分別為 KY365567（D26-2）、KY365566（D23-1）、KY365565（D22-1）、KY365575（D13-1）、KY365569（D32-6）、KY365568（D28-3）、KY365583（NQ4-3）、KY365590（Q7-6）。

圖4 基于rDNA ITS 區(qū)序列構(gòu)建的麥根腐平臍蠕孢系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 B. sorokiniana phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence

同時，以麥根腐平臍蠕孢作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，D28-1、D34-1、D3-4、NQ3-4、D33-2 這5 菌株與鏈格孢的遺傳距離為0，自展支持值大于99（1000 次重復(fù)）。結(jié)合形態(tài)特征，確定該5 株菌為鏈格孢。提交序列至GenBank，獲得的登錄號分別為 KY365561（D28-1）、KY365563（D34-1）、KY365573（D3-4）、KY365582（NQ3-4）、KY365562（D33-2）（圖 5）。

圖5 基于rDNA ITS 區(qū)序列構(gòu)建的鏈格孢系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 A. alternate phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence

2.4 致病性分析

如表2 所示，8 株麥根腐平臍蠕孢均可導(dǎo)致青稞普通根腐病的發(fā)生，發(fā)病癥狀與青稞田間苗期普通根腐病癥狀一致，除D13-1 及NQ4-3 外，其他6 株菌可100%引起青稞普通根腐病的發(fā)生，其中D32-6、Q7-6、D26-2 和D28-3 這4 株菌的致病性最強，病情指數(shù)均在80%以上，且各菌株的致病性差異顯著。經(jīng)再次分離病原觀察其形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)，與接入時一致，確認(rèn)為該種病害的病原。

表2 青稞普通根腐病病原-麥根腐平臍蠕孢的致病性Table 2 The common root rot pathogen of qinke barley-B.sorokiniana pathogenicity

如表3 所示，5 株均有致病性，致病差異顯著；鏈格孢的致病性較低，致病性最強的D28-1 發(fā)病率為89.17%，病情指數(shù)為36.42；發(fā)病癥狀與田間苗期普通根腐病輕癥一致，經(jīng)再分離發(fā)現(xiàn)，其菌株形態(tài)與接入時一致，確認(rèn)為普通根腐病病原。

表3 鏈格孢的致病性Table 3 The A.alternate pathogenicity

3 討論

目前，關(guān)于青稞根腐病的研究較少，病原研究鮮見，可查閱到的資料多為大麥根腐病的相關(guān)研究，并非其變種青稞，因此，本研究首次明確了青稞普通根腐病的病原。本研究發(fā)現(xiàn)，青稞普通根腐病的優(yōu)勢病原是麥根腐平臍蠕孢，與 Ilija 等［17］、Mohammad 等［18］和Zhong 等［4］對大麥根腐病病原的研究結(jié)果一致。也有眾多研究表明大麥根腐病的優(yōu)勢病原為鐮孢菌，主要包括燕麥鐮孢、黃色鐮孢、禾谷鐮孢、梨孢鐮孢、擬枝鐮孢等［19?22］。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，大麥根腐病是由多種病原復(fù)合侵染引起的，如 Makela 等［23］、Pua 等［24］和 Fedel 等［25］研究表明，大麥根腐病是由麥根腐平臍蠕孢和鐮孢菌屬共同引起的。Amira［26］和 Ravjit 等［27］則研究表明，絲核菌和鐮孢菌是引起大麥根腐病的優(yōu)勢病原。前人對大麥根腐病病原的研究做出了巨大貢獻，但未見將根腐病害類型作以區(qū)分。究其原因，根腐類病害發(fā)生的環(huán)境復(fù)雜，受氣候、種植、土壤等多個因素的影響，不同類型的根腐類病害往往混合發(fā)生，癥狀類似，從而對根腐類病害類型的確定造成了困難。本研究通過大量調(diào)查采樣及試驗研究發(fā)現(xiàn)以麥根腐平臍蠕孢為優(yōu)勢病原的青稞根腐類病害，其癥狀典型，與鐮孢菌根腐病等其他根腐類病害差異較大，確定為青稞普通根腐病。麥根腐平臍蠕孢是小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、柳枝稷（Panicum virgatum）等植物葉斑?。?8?30］、根腐病［31］以及燕麥（Avena sativa）褐斑?。?2］等多種作物病害的病原，其侵染規(guī)律、致病機理及各種病害之間的關(guān)系有待進一步研究。另外，近年來，越來越多的研究證明，鏈格孢能引起葉斑病、果腐病、根腐病、黑斑病等多種植物病害，其寄主廣泛，致病性強，產(chǎn)生毒素，危害嚴(yán)重［33?34］。本研究發(fā)現(xiàn)，5株鏈格孢可致病導(dǎo)致青稞根腐病的發(fā)生，但未見只分離到鏈隔孢的病株，其可能與麥根腐平臍蠕孢復(fù)合侵染或在麥根腐平臍蠕孢侵染后加重發(fā)病程度，其互作機理還有待進一步研究。

4 結(jié)論

我國西北青藏高原地區(qū)甘肅省甘南藏族自治州、青海省海東市、海北藏族自治州青稞普通根腐病發(fā)生普遍，發(fā)病率為5%～15%。青稞感染普通根腐病后葉呈黃綠色，穗白粒癟，幼苗瘦弱或死亡，根部發(fā)黑、腐爛或斷裂。青稞普通根腐病的病原為麥根腐平臍蠕孢和鏈格孢，麥根腐平臍蠕孢為優(yōu)勢病原。