杜云玲，孔令君，張 睿，吳 潔，竇亞玲

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科,北京 100730

珠蛋白生成障礙性貧血是由于珠蛋白基因缺失或突變導致珠蛋白肽鏈合成障礙的一種溶血性貧血，其屬于單基因遺傳病，具有嚴重的危害性，可分為α-珠蛋白生成障礙性貧血和β-珠蛋白生成障礙性貧血[1]。該病廣泛分布于世界各地，全球約有5.00%的人口是α-珠蛋白生成障礙性貧血的攜帶者，其中東南亞為高發(fā)區(qū)之一，在我國多見于南方地區(qū)，北方少見[2-4]。血紅蛋白H病(HbH)屬于α-珠蛋白生成障礙性貧血的中間型，分為缺失型HbH病和非缺失型HbH病。非缺失型HbH病是2個α基因缺失和1個α基因突變，結果只能合成少量正常α珠蛋白肽鏈，與多余的β鏈聚合形成異常的HbH四聚體(β4)，研究顯示非缺失型HbH病比缺失型HbH病的臨床癥狀表現(xiàn)更為嚴重[5-6]。本研究對本院1例非缺失型HbH病復合β-珠蛋白生成障礙性貧血孕婦的血液學特征和基因型進行分析，補充了復雜少見珠蛋白生成障礙性貧血基因類型的數(shù)據(jù)。此外，為臨床咨詢和產(chǎn)前干預提供依據(jù)，對降低珠蛋白生成障礙性貧血的發(fā)病率、促進優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義[7]。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者，女，36歲，孕7+周，2020年6月24日于某院血液內(nèi)科門診進行孕前檢查、珠蛋白生成障礙性貧血篩查?；颊咂綍r血紅蛋白(Hb) 80 g/L，月經(jīng)基本正常，2019年自然流產(chǎn)1次，流產(chǎn)后Hb 60 g/L。本次實驗室檢查，血常規(guī)聯(lián)合網(wǎng)織紅細胞分析：Hb 78 g/L，平均紅細胞體積(MCV)62.4 fL，紅細胞平均血紅蛋白量(MCH) 16.3 pg，紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC) 261 g/L，紅細胞分布寬度(RDW )21.00%，網(wǎng)織紅細胞血紅蛋白含量(RET%)3.47%，網(wǎng)織紅細胞血紅蛋白含量(RET#) 166.10，網(wǎng)織紅細胞血紅蛋白(CHr)21.10。外周血紅細胞形態(tài)分析：紅細胞大小不等，部分形態(tài)不規(guī)則，中心淡染區(qū)擴大，易見靶形紅細胞，見圖1。Hb電泳：HbA 93.30%，HbA2 2.50%，HbCS 1.60%，HbF 2.60%。

注：視野內(nèi)可見多個靶形紅細胞。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 全自動血液分析儀XN9100(日本Sysmex公司)；全自動電泳儀Minicap-FP(法國Sebia公司)；天隆NP968核酸提取儀(西安天隆科技有限公司)； Multiskan Go 紫外分光光度計(美國Thermo公司)；Legend Micro17離心機(美國Thermo公司)；1300 Series A2生物安全柜(美國Thermo公司)；ABI Veriti96 PCR儀；YN-H16恒溫雜交儀[亞能生物技術(深圳)有限公司]；PowerPac Basic電泳儀(美國BioRad公司)；GelDoc XR凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2.2試劑 Ex-DNA全血基因組核酸提取或純化試劑盒購自西安天隆科技有限公司；α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測試劑盒(gap-PCR法)、非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變檢測試劑盒(PCR-反向點雜交法)、β-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測試劑盒(PCR-反向點雜交法)購自亞能生物技術(深圳)有限公司。

1.3方法

1.3.1Hb電泳 空腹靜脈血2 mL，EDTA抗凝，采用法國Sebia Minicap-FP 全自動毛細管電泳儀，嚴格按照Hb電泳標準操作規(guī)范，質(zhì)控合格后上機檢測，分離出各Hb成分和比例?？蓹z出正常Hb，包括HbA、HbF和HbA2，還可檢出異常Hb，如HbH、HbCS、HbE、HbS、HbD、HbG、HbBart′s等。

1.3.2基因檢測 嚴格按照試劑說明書進行操作。使用全血快速提取試劑盒從EDTA抗凝靜脈血中提取全血基因組DNA。缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測采用gap-PCR方法，檢測常見的3種類型：--SEA、-α3.7、-α4.2。對PCR擴增產(chǎn)物進行1.00%瓊脂糖凝膠(用0.50%的TBE配制瓊脂糖)電泳，電壓90 V，電泳70 min，根據(jù)電泳片段大小判斷基因類型。采用PCR-反向點雜交方法檢測非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因和突變型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因，包括常見的3種非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因類型：αCS(CD142，TAA→CAA)、αQS(CD125，CTG→CCG)、αWS(CD122，CAC→CAG)，以及17種常見的突變型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因類型，分別為CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、-28(A→G)、CD17(AAG→TAG)、CD71-72(+A)、βE(GAG→AAG)、-29(A→G)、CD43(GAG→TAG)、CD27/28(+C)、CD14-15(+G)、CD31(-C)、-32(C→A)、-30(T→C)、IVS-Ⅰ-1(G→T)、IVS-Ⅰ-5(G→C)、5′UTR；+40-+43(-AAAC)、起始密碼子(ATG→AGG)。PCR擴增產(chǎn)物與探針進行分子雜交及顯色反應，觀察膜條上各位點信號的有無(信號為藍色斑點)，確定患者的基因型。

2 結 果

2.1Hb電泳分析結果 該孕產(chǎn)婦HbA 降低，為93.30%，HbA2 正常，為2.50%，HbCS升高，為1.60%，HbF升高，為2.60%。

2.2缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因結果 該孕產(chǎn)婦為SEA缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血，見圖2。

注：889為本例患者，為SEA 缺失型；890、891為健康者；N為陰性對照；PSEA為SEA缺失型陽性對照；M為Marker。

2.3非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因結果 該孕產(chǎn)婦HbCS突變型出現(xiàn)顯色斑點，而HbWS、HbQS野生型出現(xiàn)顯色斑點，結果為HbCS純合突變。

2.4突變型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因結果 該孕產(chǎn)婦-28M突變型出現(xiàn)顯色斑點，而41-42N、654N、-28N、71-72N、17N、βEN、31N野生型出現(xiàn)顯色斑點，結果判斷為β珠蛋白基因-28(A→G)雜合突變。

3 討 論

本例孕婦Hb 78 g/L表現(xiàn)為中度貧血，MCV 62.4 fL，MCH 16.3 pg，MCHC 261 g/L，血象為小細胞低色素貧血。有研究表明，α-珠蛋白生成障礙性貧血復合β-珠蛋白生成障礙性貧血后，由于α-鏈合成減少的同時，β-鏈合成亦減少，二者的不平衡狀態(tài)得以減輕，故患者的貧血程度較單純的α-珠蛋白生成障礙性貧血或單純的β-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子患者可以得到一定程度的改善，其貧血癥狀也會有所減輕，表現(xiàn)為中間型珠蛋白生成障礙性貧血[8]。

當進行Hb電泳檢測時，相較于單純的HbH病患者，HbH病復合β-珠蛋白生成障礙性貧血患者常出現(xiàn)HbH區(qū)帶及HbA2水平明顯升高的情況[9]。另有研究[10]報道，約68.40%的HbH病復合β-珠蛋白生成障礙性貧血患者HbA2水平增高，31.60%患者HbA2水平正常；此外，只有5.20%的HbH病復合β-珠蛋白生成障礙性貧血患者會出現(xiàn)HbH。本研究中患者Hb電泳出現(xiàn)HbA2水平正常，未檢出HbH，這與玉晉武等[10]報道一致，因為同時復合了β-珠蛋白生成障礙性貧血，致使β鏈不再過剩，HbH水平很低，導致進行Hb電泳分析時未見HbH區(qū)帶。因此，當只依靠Hb電泳進行珠蛋白生成障礙性貧血篩查時，很容易漏檢或誤診，臨床在依據(jù)血液學參數(shù)的同時，必要時也應該進行珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測，以進一步明確診斷，為治療提供可靠依據(jù)。

本例α-珠蛋白生成障礙性貧血孕婦為SEA雜合缺失，CS單體型，即--SEA/αCS，β-珠蛋白生成障礙性貧血為-28(A→G)突變。對于這種復合型珠蛋白生成障礙性貧血患者，無論同α-珠蛋白生成障礙性貧血或β-珠蛋白生成障礙性貧血患者進行婚配，均有可能生育出中間型或重型患兒。α-珠蛋白基因的缺失程度與α-珠蛋白生成障礙性貧血的嚴重程度相關。當4個α-珠蛋白基因缺失或缺陷，可導致完全無α鏈生成，此類胎兒僅有γ4(HbBart′s)，可缺氧致死，大多在妊娠30～40周時成為死胎而流產(chǎn)或早產(chǎn)后數(shù)小時內(nèi)死亡；3個α-珠蛋白基因缺失或缺陷，患者僅能合成少量α鏈，容易在紅細胞內(nèi)變形沉淀而形成包涵體，造成紅細胞膜僵硬而使紅細胞壽命縮短，導致HbH??；2個α-珠蛋白基因缺失或缺陷時，有相當數(shù)量的α鏈合成，攜帶者生理改變輕微；靜止型α-珠蛋白生成障礙性貧血僅有1個α基因缺失或缺陷，α鏈合成略微減少，患者生理改變非常輕微[11-13]。所以在婚前體檢時，為了避免下一代出現(xiàn)基因缺陷疾病，應該進行珠蛋白生成障礙性貧血檢查。

珠蛋白生成障礙性貧血作為我國南方常見的遺傳性血液疾病之一，一直以來北方地區(qū)報道較少，但隨著人口的遷移及南北通婚的增多，北方地區(qū)患病的人數(shù)也有所增加。本研究的病例基因型為非缺失型HbH病復合β-珠蛋白生成障礙性貧血，該種復合基因型在南方地區(qū)如廣西、廣東等有發(fā)現(xiàn)，但在北方地區(qū)少有報道[14-15]。因此，在臨床工作中要重視αβ復合型珠蛋白生成障礙性貧血的存在，尤其要在北方地區(qū)開展珠蛋白生成障礙性貧血的實驗室診斷，這對于預防重型珠蛋白生成障礙性貧血患兒的出生具有重要的指導意義。