吳莉萍 高學(xué)仁 王建國(guó)

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其全球發(fā)病率居高不下且存在明顯的地域差異[1-2]。我國(guó)屬于CRC低發(fā)國(guó)家，但是近年來(lái)隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人口老齡化以及生活方式的改變，CRC發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[3]。目前雖然學(xué)者們對(duì)CRC的診斷、治療及發(fā)病機(jī)制等做了大量研究工作，但由于CRC具有發(fā)現(xiàn)晚、侵襲性強(qiáng)、致病機(jī)制復(fù)雜等特性[4]，亟需探討其診斷標(biāo)志物及分子致病機(jī)制，從而為早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供新的思路。ZNF667-AS1屬于鋅指蛋白667反義鏈RNA，作為一種長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）參與多種細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，進(jìn)而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展[5]。ZNF667-AS1最早在乳腺上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，其在多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)[6]。目前關(guān)于ZNF667-AS1的研究報(bào)道較少，在CRC中的生物學(xué)功能也尚不清楚，故本研究檢測(cè)了ZNF667-AS1在CRC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，并結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探討ZNF667-AS1在CRC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 標(biāo)本cDNA來(lái)源 CRC組織及癌旁（距離癌組織5 cm處）正常組織標(biāo)本來(lái)自2017年3月至2019年3月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院接受CRC切除手術(shù)治療的24例CRC患者，組織標(biāo)本cDNA由高學(xué)仁教授惠贈(zèng)。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療，術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)。本研究經(jīng)嘉興市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞系 人CRC細(xì)胞系（HCT116、SW480、Lovo）、結(jié)直腸上皮細(xì)胞系（NCM460）均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.3 主要試劑 pCDNA3.1-ZNF667-AS1過(guò)表達(dá)載體由上海生物工程股份有限公司構(gòu)建；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FBS、DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；馬血清購(gòu)自上海生物工程有限公司；Trizol購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒5X Prime ScriptRTMaster Mix購(gòu)自美國(guó)TaKaRa公司；RT-PCR試劑qPCR SYBR Master Mix購(gòu)自美國(guó)YEASEN公司；所有引物在上海生工科技有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 ZNF667-AS1過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 利用PCR法從人類基因組中擴(kuò)增ZNF667-AS1序列，雙酶切將目的基因通過(guò)T4鏈接酶構(gòu)建到pCDNA3.1-N1空載體上。采用雙酶切法及Sanger測(cè)序方法鑒定pCDNA3.1-ZNF667-AS1載體構(gòu)建成功。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SW480、HCT116細(xì)胞，含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Lovo細(xì)胞，含10%馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)NCM460細(xì)胞，各添加0.1 U/L青霉素、0.1 U/L鏈霉素，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰酶消化傳代。

1.4.3 細(xì)胞系構(gòu)建 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞，按5×105個(gè)/孔接種至6孔板中；待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%融合時(shí)，分別將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pCDNA3.1-ZNF667-AS1）和空載體（pCDNA3.1-N1）4 μg 稀釋在 250 μl無(wú)血清 RPMI1640 培養(yǎng)基中，6 μl Lipofectamine 2000稀釋在 250 μl無(wú)血清 RPMI1640中，分別單獨(dú)孵育5 min后混合，37℃孵育20 min轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換新鮮的含10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pCDNA3.1-ZNF667-AS1）細(xì)胞為過(guò)表達(dá)組，轉(zhuǎn)染空載體（pCDNA3.1-N1）為空載組，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞為對(duì)照組。

1.4.4 ZNF667-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用RT-qPCR法。取100 mg組織標(biāo)本或1×105個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞，采用Trizol法提取組織標(biāo)本或細(xì)胞中總RNA，參照Prime－ScriptRTMaster Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在10 μl體系中加入500 ng總RNA進(jìn)行cDNA合成。PCR選用2×qPCR SYBR Master Mix，以適量cDNA作為模板，引物濃度0.4 μmol/L；每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置4個(gè)平行樣，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)合成相應(yīng)上下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；以β-actin作為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 ZNF667-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4.5 ZNF667-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響 采用CCK-8法。將過(guò)表達(dá)組、空載組及對(duì)照組細(xì)胞胰酶消化后，重懸于完全培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度至20 個(gè)/μl；按 100 μl/孔加入 96 孔板中，每組設(shè) 5 個(gè)復(fù)孔。每孔加入10 μl CCK-8，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h，連續(xù)測(cè)量 0、24、48、72、96 h 時(shí)在 450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值（OD450）。

1.4.6 ZNF667-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞克隆形成的影響 采用平板克隆實(shí)驗(yàn)。將過(guò)表達(dá)組、空載組及對(duì)照組細(xì)胞胰酶消化后重懸，以1 000個(gè)/孔接種于6孔板中，每5 d換1次培養(yǎng)液，第11～14天在顯微鏡下可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)＞100個(gè)時(shí)吸去培養(yǎng)液，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min后干燥，拍照并計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC組織與癌旁正常組織中ZNF667-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與癌旁正常組織比較，CRC組織中ZNF667-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 結(jié)直腸癌（CRC）組織與癌旁正常組織中ZNF667-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（*P＜0.05）

2.2 人CRC細(xì)胞系與結(jié)直腸上皮細(xì)胞系中ZNF667-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與結(jié)直腸上皮細(xì)胞系NCM460 比較，人 CRC 細(xì)胞系（HCT116、SW480、Lovo）ZNF667-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖 2。

圖2 結(jié)直腸癌（CRC）細(xì)胞系與結(jié)直腸上皮細(xì)胞系中ZNF667-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（*P＜0.05）

2.3 CRC細(xì)胞系ZNF667-AS1過(guò)表達(dá)驗(yàn)證 在HCT116、SW480細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)組ZNF667-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于空載組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖3。提示構(gòu)建ZNF667-AS1過(guò)表達(dá)模型成功，本研究選取SW480細(xì)胞的ZNF667-AS1過(guò)表達(dá)模型用于后續(xù)增殖實(shí)驗(yàn)。

圖3 結(jié)直腸癌（CRC）細(xì)胞系中ZNF667-AS1過(guò)表達(dá)驗(yàn)證（a：SW480；b：HCT116；與空載組比較，*P＜0.05）

2.4 ZNF667-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響 ZNF667-AS1過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組OD450值在第24 h時(shí)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；在第 48、72、96 h時(shí)ZNF667-AS1過(guò)表達(dá)組OD450值明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且隨時(shí)間的推移，差異逐漸增大，見(jiàn)圖4。

圖4 ZNF667-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響（OD為吸光度值；*P＜0.05）

2.5 ZNF667-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞克隆形成的影響 ZNF667-AS1過(guò)表達(dá)組所形成的克隆數(shù)為（122±11）個(gè)，明顯少于對(duì)照組的（361±13）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖 5。

圖5 ZNF667-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞克隆形成的影響（×10）

3 討論

lncRNA是一類長(zhǎng)度＞200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等過(guò)程，在細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲中發(fā)揮重要作用；同時(shí)能通過(guò)與多種微小RNA等相互作用，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7-10]。ZNF667-AS1作為一種lncRNA，長(zhǎng)度為1837bp，位于19號(hào)染色體19q13.43。相關(guān)研究最早報(bào)道ZNF667-AS1在心肌缺血組織中高表達(dá)[11-12]，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受缺氧損傷[13]。相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，ZNF667-AS1基因在乳腺癌、結(jié)腸腺瘤、子宮頸癌等十幾種腫瘤中呈低表達(dá)，主要出現(xiàn)在癌變?cè)缙赱13-14]。近期亦有研究發(fā)現(xiàn)ZNF667-AS1通過(guò)抑制JAKU-STAT通路來(lái)抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)脊髓損傷恢復(fù)[15]。在腫瘤中，ZNF667-AS1可通過(guò)激活A(yù)NK2/JAK2表達(dá)來(lái)抑制CRC細(xì)胞侵襲[16]。本文就ZNF667-AS1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響作一探討。

本研究發(fā)現(xiàn)，ZNF667-AS1在CRC組織中的mRNA相對(duì)表達(dá)量較癌旁正常組織明顯降低，提示ZNF667-AS1 mRNA低表達(dá)與CRC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Zhao等[13]研究表明，ZNF667-AS1 mRNA低表達(dá)是CRC的獨(dú)立預(yù)后因子，與本研究結(jié)果一致。本研究通過(guò)檢測(cè)不同CRC細(xì)胞系ZNF667-AS1 mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與結(jié)直腸上皮細(xì)胞比較，ZNF667-AS1在CRC細(xì)胞中的mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ZNF667-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與CRC細(xì)胞增殖及克隆形成有關(guān)，在SW480細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)ZNF667-AS1，CRC細(xì)胞增殖能力明顯下降，克隆形成明顯減少。

綜上所述，ZNF667-AS1在CRC組織中呈低表達(dá)，過(guò)表達(dá)ZNF667-AS1可抑制CRC細(xì)胞增殖及克隆形成能力，提示ZNF667-AS1作為一個(gè)抑癌因子，參與CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖進(jìn)程，可能作為潛在的生物靶點(diǎn)發(fā)揮生物學(xué)功能。