俞儀萱 楊濤 張靜怡 魯星妤 董慧靜 胡紫馨 崔慧娟

食管癌是一種以進(jìn)行性吞咽困難為主要表現(xiàn)的消化道惡性腫瘤。我國(guó)食管癌的死亡率位居惡性腫瘤的第六位[1]，5年生存率僅20%[2]。近年來，食管癌免疫治療技術(shù)不斷進(jìn)展[3]。基于KEYNOTE-590的研究結(jié)果[4]，美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（national comprehensive cancer network，NCCN）惡性腫瘤臨床實(shí)踐指南推薦將帕博利珠單抗（pembrolizumab）作為程序性死亡蛋白配體 1（programmed death protein-ligand 1，PD-L1）高表達(dá)或錯(cuò)配修復(fù)缺陷、微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定食管癌患者的二線標(biāo)準(zhǔn)治療方案。然而，僅有小部分食管癌患者能從免疫治療中取得良好效果，篩選潛在獲益人群的相關(guān)生物標(biāo)志物仍亟待探索。腫瘤免疫浸潤(rùn)特點(diǎn)是指腫瘤微環(huán)境中各類浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞聚集分布的特征。研究證實(shí)，免疫浸潤(rùn)特點(diǎn)是影響食管癌免疫治療臨床獲益的關(guān)鍵因素[5-6]，同時(shí)，浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞可用于評(píng)估預(yù)后[7]或作為候選的治療靶點(diǎn)[8]。本研究采集癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中食管癌組織的基因轉(zhuǎn)錄本與患者的臨床特征，采用CIBERSORT算法[9]，對(duì)食管癌組織中22種浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的構(gòu)成比進(jìn)行測(cè)算，分析它們與預(yù)后的相關(guān)性，并構(gòu)建生存預(yù)后模型，揭示食管癌的免疫微環(huán)境，為免疫治療相關(guān)生物標(biāo)志物的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取 食管癌患者食管癌組織的基因轉(zhuǎn)錄本及臨床特征均從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cancergenome.nih.gov/）獲取，包含160例食管癌組織樣本和11例正常食管組織樣本?；颊叩呐R床特征包括性別、生存狀態(tài)、生存時(shí)間、腫瘤分期、TNM分期等，共183例。并在R軟件中使用limma包對(duì)轉(zhuǎn)錄本特征進(jìn)行校正。同時(shí)，從基因表達(dá)綜合（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載包含食管癌組織和正常食管組織樣本的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集GSE26886用于驗(yàn)證。

1.2 研究方法 采用CIBERSORT算法計(jì)算食管癌組織及正常食管組織基因轉(zhuǎn)錄本中浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的構(gòu)成比，使用標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)數(shù)據(jù)評(píng)估樣本中22種浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的構(gòu)成比。使用R軟件中的survival包、survivalROC包對(duì)浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的構(gòu)成比與臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析，建立Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0和R 4.0.3統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞與臨床生存情況的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織的免疫浸潤(rùn)特點(diǎn) 經(jīng)CIBERSORT算法測(cè)算后，篩選P＜0.05的樣本，得到食管癌組織樣本94例，正常食管組織樣本5例。計(jì)算樣本中22種浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的構(gòu)成比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在食管癌組織中占比最高的3種浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞分別為未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞（20.28%）、M0巨噬細(xì)胞（16.64%）和M2巨噬細(xì)胞（11.50%）。

相關(guān)性熱圖反映了食管癌組織中浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞之間的關(guān)聯(lián)，見圖1（插頁），結(jié)果顯示，活化的CD4+記憶性T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞呈正相關(guān)（r=0.49，P＜0.05），濾泡輔助性T細(xì)胞（T cells follicular helper，Tfh）與未活化的 CD4+記憶性 T 細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（r=-0.47，P＜0.05）。

圖1 食管癌組織免疫細(xì)胞相關(guān)性熱圖

2.2 食管癌組織與正常食管組織免疫浸潤(rùn)特點(diǎn)比較比較食管癌組織與正常食管組織中浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞構(gòu)成比的差異，并使用GSE26886的數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）（P＜0.05）、未活化的肥大細(xì)胞（P＜0.05）和M0巨噬細(xì)胞（P＜0.05）的構(gòu)成比在兩組樣本間存在差異。其中，未活化的肥大細(xì)胞在食管癌組織中的構(gòu)成比低于正常食管組織，M0巨噬細(xì)胞在食管癌組織中的構(gòu)成比高于正常食管組織。

2.3 食管癌組織樣本臨床基本特征 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載183例食管癌組織樣本的臨床基本特征，對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見表1。其中臨床特征未知者，統(tǒng)計(jì)該項(xiàng)時(shí)予以剔除。

表1 食管癌組織樣本臨床基本特征

2.4 食管癌組織浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞構(gòu)成比與臨床特征的關(guān)系 分析食管癌組織浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞構(gòu)成比與臨床基本特征（包括性別、腫瘤分期、TNM分期等）的關(guān)系。結(jié)果顯示，男性食管癌患者具有更高構(gòu)成比的未活化的肥大細(xì)胞（P＜0.05），高構(gòu)成比的活化的DCs與食管癌較低的T分期有關(guān)（P＜0.05），見圖2。

圖2 兩種浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞構(gòu)成比與臨床特征的關(guān)系

2.5 浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞構(gòu)成比與生存預(yù)后的關(guān)系 以每種浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞在所有食管癌組織樣本中的中位值為界，將樣本劃分為低構(gòu)成比組（Low）與高構(gòu)成比組（High），通過Kaplan-Meier法分析發(fā)現(xiàn)，高構(gòu)成比未活化的DCs可能預(yù)示著較短的生存時(shí)間（P＜0.05），見圖3。

圖3 未活化的樹突狀細(xì)胞（DCs）低構(gòu)成比組與高構(gòu)成比組患者生存曲線比較

2.6 食管癌浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞相關(guān)生存預(yù)后模型的建立將樣本中浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的構(gòu)成比納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，結(jié)果表明，高表達(dá)的Tfh（P＜0.05）與未活化的DCs（P＜0.05）細(xì)胞提示較差的生存預(yù)后，見圖4a。結(jié)合Kaplan-Meier法分析結(jié)果及相關(guān)研究[10]，將兩者納入生存預(yù)后模型的構(gòu)建，得到食管癌患者5年生存期預(yù)后的公式：5年生存率=0.4047×Tfh的比例+0.3181×未活化的DCs的比例。

在此基礎(chǔ)上，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)，將患者分為低免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組和高免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組。生存曲線提示，低免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組相比高免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組的預(yù)后更好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ROC曲線反映該模型可以較好預(yù)測(cè)患者的5年生存率（AUC=0.732），見圖4b。

圖4 食管癌免疫浸潤(rùn)C(jī)ox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型的評(píng)價(jià)（a：高、低免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組的生存曲線；b：生存預(yù)后模型評(píng)價(jià)的ROC曲線）

3 討論

食管癌免疫微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后關(guān)系密切[11]，同時(shí)，免疫浸潤(rùn)特點(diǎn)會(huì)影響患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）的反應(yīng)[12]。以往通過免疫組化、流式細(xì)胞學(xué)等方式測(cè)定腫瘤組織中浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的構(gòu)成比具有一定的難度，很難展現(xiàn)食管癌組織的免疫全景。同時(shí)，傳統(tǒng)的免疫標(biāo)志物如腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）、PD-L1 等[13]尚不能精準(zhǔn)地預(yù)測(cè)免疫治療的療效。研究者們致力于探索更簡(jiǎn)便的方式篩選食管癌免疫療法獲益的潛在人群。

本研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌組織的浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophage，TAM）[14]的構(gòu)成比較正常食管組織高，未活化的肥大細(xì)胞的構(gòu)成比較正常食管組織低，筆者認(rèn)為它們可能與食管癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)；而Tfh和DCs則與食管癌患者生存預(yù)后有關(guān)。

TAM包括未活化的M0巨噬細(xì)胞、促炎癥的M1巨噬細(xì)胞及免疫抑制性M2巨噬細(xì)胞[15]，它們與炎癥反應(yīng)及腫瘤抑制有關(guān)，在腫瘤組織附近聚集，塑造著腫瘤免疫微環(huán)境。以往的研究與本研究均證實(shí)了食管癌組織中TAM構(gòu)成比較正常食管組織更高[16]，但并非所有亞型都表達(dá)出了明顯的差異，比如M2巨噬細(xì)胞。TAM亞型的表達(dá)構(gòu)成比可能與食管癌患者預(yù)后有關(guān)[17]，但本研究的結(jié)果并沒有充分表達(dá)這一特點(diǎn)。目前，針對(duì)TAM的療法[18]及評(píng)估PD-1/PD-L1表達(dá)和TAM構(gòu)成比聯(lián)系的研究[19]正在進(jìn)行，而TAM亞型或可成為治療的新靶標(biāo)。

未活化的肥大細(xì)胞在正常食管組織、食管癌組織中構(gòu)成比不同，不同性別中也存在差異。既往的研究無法明確高構(gòu)成比的肥大細(xì)胞對(duì)于機(jī)體免疫能力的調(diào)節(jié)作用[20-21]，Derakhshani等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞所發(fā)揮的作用取決于腫瘤類型等多種因素。本研究對(duì)肥大細(xì)胞的分析較為局限，然而，隨著性別對(duì)于免疫療法尤其是免疫檢查點(diǎn)抑制劑的影響逐漸受到關(guān)注與肯定[23-24]，未來或可加深對(duì)浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞亞型與性別聯(lián)系的研究。

本研究以Tfh、未活化的DCs為指標(biāo)構(gòu)建出了食管癌生存預(yù)后的模型，結(jié)果表明高構(gòu)成比的未活化DCs和Tfh提示著較差的生存預(yù)后。DCs與食管癌的免疫浸潤(rùn)特點(diǎn)關(guān)系密切，研究中它顯示出了與T分期、生存預(yù)后等的聯(lián)系。高表達(dá)的活化的DCs與食管癌較低的T分期相關(guān)，與既往的研究結(jié)果相符[25-26]。但同時(shí)說明，DCs可能只影響原位癌的分期，與淋巴結(jié)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系不強(qiáng)。然而，研究中高構(gòu)成比的未活化的DCs又與較差的生存預(yù)后相關(guān)，似乎與“較低的T分期”這一結(jié)果相左。這種可能是DCs的活化狀態(tài)不同所導(dǎo)致的：食管癌微環(huán)境中含有大量腫瘤抗原，更多的成熟DCs提供了更強(qiáng)的抗原提呈力，則T分期低。未活化的DCs抗原提呈力弱，伴隨著較低的免疫效能，故預(yù)后差。這提示不同活化狀態(tài)的DCs可能是獨(dú)立在食管癌發(fā)生、發(fā)展、臨床預(yù)后中發(fā)揮作用的。但是，Nishimura等[27]應(yīng)用免疫組化法測(cè)定食管鱗癌組織的DCs，認(rèn)為更精確的生存模型需建立在對(duì)DCs表型LAMP-3的測(cè)定之上，只有表達(dá)出LAMP-3的成熟DCs，才直接主導(dǎo)了食管癌患者的免疫反應(yīng)。這或可為近年來基于DCs的疫苗開發(fā)提供支持[28]。

Tfh的構(gòu)成比在本研究中也顯示出與較差的預(yù)后相關(guān)。Tfh可以幫助B細(xì)胞建立生發(fā)中心，間接調(diào)節(jié)體液免疫，在食管癌及其他實(shí)體瘤的腫瘤微環(huán)境中起到調(diào)控作用[29]。已有的研究指出，Tfh的構(gòu)成比與乳腺癌[30]、肺癌[31]等的生存預(yù)后有關(guān)。Tfh細(xì)胞上高表達(dá)PD-1，高構(gòu)成比的Tfh可能是由于PD-1/PD-L1信號(hào)通路被阻斷而產(chǎn)生的[32]，這不僅使腫瘤免疫整體趨向體液免疫，同時(shí)也不利于機(jī)體發(fā)揮免疫作用。

綜上所述，本研究呈現(xiàn)了食管癌免疫浸潤(rùn)的特點(diǎn)，揭示了22種浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞與食管癌臨床特征、預(yù)后的關(guān)系，為食管癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的探索、免疫治療效果預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的選擇提供了參考。但本研究仍存在一定的局限：（1）TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中包含的正常食管組織樣本較少，盡管本研究使用了GEO數(shù)據(jù)集進(jìn)行了驗(yàn)證，但未來仍需納入更多的外部數(shù)據(jù)提高結(jié)果的可靠性；（2）某些臨床數(shù)據(jù)缺乏年齡、分級(jí)、無進(jìn)展生存期等特征，且各組間食管癌樣本數(shù)量分布不均，導(dǎo)致本研究無法全面評(píng)估免疫浸潤(rùn)特點(diǎn)與臨床特征的關(guān)系；（3）缺乏亞洲來源的樣本，由于種族間的免疫差異，研究對(duì)于我國(guó)食管癌患者的適用性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。