楊 坤 劉小帥 李天才 向成權(quán) 趙宇航 饒 強(qiáng) 宋昭彬,

(1. 西華師范大學(xué)生態(tài)研究院, 南充 637002; 2. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610065; 3. 雅礱江流域水電開發(fā)有限公司, 成都 610051; 4. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610065)

鱸鯉(Percocypris pingi)隸屬鯉形目、鯉科、鱸鯉屬, 俗稱花鯉、江鯉等, 在岷江、雅礱江和金沙江下段等水系均有分布, 是產(chǎn)區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)魚類[1]。由于受水利水電工程修建和過(guò)度捕撈等影響, 鱸鯉的野生資源明顯衰退[2], 已被列為四川省重點(diǎn)保護(hù)魚類及《中國(guó)生物多樣性紅色名錄——脊椎動(dòng)物卷》瀕危物種[3]。為保護(hù)和恢復(fù)野外的鱸鯉資源, 在大渡河、雅礱江及金沙江等水域陸續(xù)開展了人工增殖放流。選用合適的方法標(biāo)記放流魚類,是評(píng)價(jià)放流效果、監(jiān)測(cè)人工增殖放流是否達(dá)到預(yù)期效果的重要途徑之一, 但國(guó)內(nèi)相關(guān)研究較為薄弱[4], 對(duì)于鱸鯉放流更是如此。因而, 迫切需要尋找合適的方法標(biāo)記放流的鱸鯉。

我國(guó)鱸鯉人工增殖放流主要由分布各地的魚類增殖放流站采用當(dāng)年繁殖、當(dāng)年或次年放流的方式實(shí)施, 放流魚苗規(guī)格小(以全長(zhǎng)4—10 cm為主),放流規(guī)模較大(萬(wàn)尾以上)。切鰭、T型標(biāo)志、CWT金屬線碼標(biāo)志、PIT電子標(biāo)志及DNA分子標(biāo)記等魚類標(biāo)記/標(biāo)志方法, 由于要求魚體規(guī)格大、損傷魚體、價(jià)格較高或技術(shù)復(fù)雜等諸多因素, 均不適宜當(dāng)前鱸鯉的人工增殖放流方式。耳石(Otolith)是真骨魚類內(nèi)耳中以碳酸鈣為主要組分的礦化結(jié)構(gòu), 其結(jié)構(gòu)和組成非常穩(wěn)定, 在整個(gè)生活史中不會(huì)被破壞或重吸收, 對(duì)魚類經(jīng)歷的某些生理和環(huán)境條件(特別是水溫)變化較為敏感且具有一定的規(guī)律性, 因此可以作為一種良好的標(biāo)記載體[5—7]。熱標(biāo)記(Thermal marking)和熒光標(biāo)記(Fluorescent marking)是標(biāo)記魚類耳石的常用方法, 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于大規(guī)模標(biāo)記早期生長(zhǎng)階段的魚類[8,9]。一些學(xué)者研究了短須裂腹魚(Schizothorax wangchiachii)[10]、長(zhǎng)薄鰍(Leptobotia elongata)[11]、重口裂腹魚(Schizothorax davidi)[12]和胭脂魚(Myxocyprinus asiaticus)[13]等魚類耳石標(biāo)記, 表現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。本研究基于鱸鯉人工增殖放流的現(xiàn)實(shí)需求, 探討鱸鯉早期魚苗(仔魚期和稚魚期)耳石熱標(biāo)記和熒光標(biāo)記的可行性, 并嘗試將這2種標(biāo)記方法結(jié)合使用, 以期為鱸鯉大規(guī)模標(biāo)記、人工放流群體跟蹤及放流效果評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 魚苗來(lái)源與管理

鱸鯉仔魚由雅礱江錦屏·官地水電站魚類增殖放流站人工繁育, 本研究的實(shí)驗(yàn)亦在該站完成。為確保日齡和規(guī)格基本一致, 仔魚為一對(duì)雌雄親魚的受精卵孵化。仔魚暫養(yǎng)在直徑為1 m的圓柱形不透明玻璃缸中, 保持不間斷微流水和增氧。每天8:00、12:00、16:00和20:00各投喂浮性微顆粒飼料1次; 每天吸取污物1次, 換水約1/3; 每2天徹底換水1次并清洗水槽; 每天8:00、14:00和20:00測(cè)量水溫并記錄。

1.2 耳石熱標(biāo)記

水溫控制使用一個(gè)自制的水溫控制系統(tǒng)控制熱標(biāo)記所需的水溫。該系統(tǒng)每個(gè)標(biāo)記單元由1個(gè)室內(nèi)水泥魚池、2個(gè)鋼化塑料水箱(水箱a規(guī)格長(zhǎng)100 cm×寬80 cm×高80 cm、水箱b規(guī)格長(zhǎng)50 cm×寬40 cm×高40 cm)和2個(gè)恒溫電加熱棒(電氣參數(shù):控溫20—34℃, 50—60 Hz, 220—240 V, 300 W)組成。加熱棒分別置于2個(gè)水箱中, 設(shè)置相同的溫度。魚池高于地面約1 m, 用于沉淀水中的泥沙, 提供“低溫水”。水源來(lái)自附近一條長(zhǎng)年不斷流的小溪, 溪水在鱸鯉繁殖季節(jié)(每年4—5月份)的溫度7—9℃, 魚池水溫可維持在9—10℃。水箱a用于提供“高溫水”, 水箱b用于盛裝待標(biāo)記的魚苗。在熱標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中, 當(dāng)需要高溫水時(shí), 直接開啟水箱b中的加熱棒(設(shè)置溫度21℃)。當(dāng)需要低溫水時(shí), 先關(guān)閉水箱b中的加熱棒, 然后放掉大約70%的高溫水, 再緩慢(約30min)加入魚池中的低溫水。在高溫水飼養(yǎng)期間, 使用一個(gè)100 W白熾燈提供光照; 每隔6h投喂1次標(biāo)記中的魚苗; 投喂結(jié)束1h后, 清除殘餌及糞便, 并使用水箱a中的高溫水換掉水箱b中約70%的水。在低溫水飼養(yǎng)期間, 不提供光照, 不投喂。實(shí)驗(yàn)通過(guò)高低溫交替, 模擬晝夜交替。實(shí)驗(yàn)期間保持不間斷增氧(溶氧7—8 mg/L)。

熱標(biāo)記方案隨機(jī)選取20日齡鱸鯉1200尾,平均分成4組, 使用上述水溫控制系統(tǒng)實(shí)施熱標(biāo)記,將魚苗在高溫水和低溫水中循環(huán)飼養(yǎng), 高溫期水溫(20.8±0.3)℃, 低溫期(10.8±1.2)℃, 水溫波動(dòng)周期方案見(jiàn)表1。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí), 每組隨機(jī)挑選50尾魚苗,保存在99.7%的乙醇中, 以待摘取耳石。

表1 鱸鯉仔魚耳石熱標(biāo)記方案Tab. 1 Experimental design of otolith thermal marking for larval P. pingi

1.3 耳石熒光標(biāo)記

熒光染料使用的熒光染料為茜素絡(luò)合物(Alizarin complexone, AC)和茜素紅(Alizarin red S,ARS), 均為分析純粉劑, 由德國(guó)Ruibio生產(chǎn), 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司分裝。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案, 用澄清48h以上的溪水配制成相應(yīng)濃度的熒光染料溶液。

標(biāo)記方案當(dāng)完成耳石熱標(biāo)記后的鱸鯉仔魚生長(zhǎng)至35日齡時(shí)[全長(zhǎng)(21.30±0.45) mm], 從熱標(biāo)記組1中隨機(jī)選取80尾, 從熱標(biāo)記組2中隨機(jī)選取100尾。暫養(yǎng)24h后, 使用AC溶液或ARS溶液浸泡魚體,浸泡時(shí)間為24h。45日齡時(shí)[全長(zhǎng)(28.56±1.03) mm],使用相同條件重復(fù)標(biāo)記1次。具體標(biāo)記方案見(jiàn)表2。在實(shí)驗(yàn)期間, 魚苗飼養(yǎng)在21.5 cm(長(zhǎng))×13.5 cm(寬)×6.5 cm(高)的白色塑料水槽中, 貯水(或熒光染料溶液)1 L; 每天8:00、12:00和16:00, 各投喂1次浮性微顆粒飼料(熒光染料溶液浸泡時(shí)不投喂); 每天吸取污物1次并換水約1/3, 每2天徹底換水1次并清洗水槽; 保持不間斷增氧; 水溫19.5—21℃。每次熒光染料浸泡結(jié)束后, 將水槽清洗干凈并換上清潔的水, 24h后統(tǒng)計(jì)死亡率。第二次標(biāo)記結(jié)束10d后,將魚體全部保存在99.7%的乙醇中。

表2 鱸鯉耳石熒光標(biāo)記方案Tab. 2 Experimental design of otolith fluorescent immersion marking for P. pingi

1.4 耳石的摘取與標(biāo)記檢測(cè)

耳石摘取在解剖鏡下, 用解剖針剖開鱸鯉頭骨, 取出3對(duì)耳石(微耳石、矢耳石和星耳石), 依次用清水、無(wú)水酒精清洗、晾干, 再用中性樹膠封于載玻片上, 于無(wú)塵干燥處晾干, 最后貼上標(biāo)簽。

耳石熱標(biāo)記檢測(cè)使用Olympus BX53顯微鏡和Q-Imaging Retiga 4000R組成的照相系統(tǒng), 在可見(jiàn)光下檢測(cè)耳石的熱標(biāo)記輪紋并拍照。采用宋昭彬[14]的方法測(cè)量微耳石輪紋寬度。

耳石熒光標(biāo)記檢測(cè)在Olympus BX40熒光顯微鏡下, 使用10×物鏡, 分別在可見(jiàn)光和綠光(WG)兩種激發(fā)光下檢測(cè)耳石的熒光標(biāo)記。根據(jù)Yang等[11]的方法將熒光標(biāo)記質(zhì)量分為6個(gè)等級(jí):0. 熒光下不能看到標(biāo)記; 1. 熒光下能看到微弱的標(biāo)記;2. 熒光下能較容易地看到標(biāo)記; 3. 熒光下能看到非常明顯甚至耀眼的標(biāo)記; 4. 熒光下能看到明顯的標(biāo)記, 普通可見(jiàn)光下也能看到標(biāo)記; 5. 熒光下能看到明顯的標(biāo)記, 普通可見(jiàn)光下也能看到非常明顯的標(biāo)記。當(dāng)標(biāo)記質(zhì)量 ≥ 3時(shí), 被稱之為優(yōu)質(zhì)標(biāo)記。優(yōu)質(zhì)標(biāo)記的熒光顏色橘紅色或鮮紅色, 色澤飽滿光亮,能夠被快速的讀取到。檢測(cè)分2次獨(dú)立進(jìn)行, 當(dāng)2次結(jié)果出現(xiàn)不一致時(shí), 再進(jìn)行第3次檢測(cè), 以確定一個(gè)唯一的檢測(cè)結(jié)果。使用顯微鏡連接的Q-Imaging MicroPublisher 5.0 RTV CCD拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2016初步整理后, 再使用SPSS 19.0對(duì)熱標(biāo)記輪紋寬度進(jìn)行單因素方差分析(事后檢驗(yàn)采用S-N-K), 對(duì)熒光標(biāo)記質(zhì)量進(jìn)行多因素方差分析(事后檢驗(yàn)采用LSD)。

2 結(jié)果

2.1 耳石熱標(biāo)記

鱸鯉微耳石形態(tài)規(guī)則, 輪紋最為明顯, 矢耳石和星耳石輪紋則不易辨別; 在高溫水飼養(yǎng)期間, 微耳石上沉積寬而透明的明帶, 低溫期間形成窄而暗的暗帶; 在不同的水溫波動(dòng)模式之間, 微耳石輪紋增長(zhǎng)的寬度和數(shù)量存在差異(圖1)。高溫期持續(xù)時(shí)間不同, 微耳石輪紋的寬度差異極顯著(One-way-ANOVA: S-N-K,P<0.01; 表3), 輪紋寬度(Increment width of lapilli,IW)與高溫水飼養(yǎng)持續(xù)時(shí)間(T)呈顯著線性關(guān)系, 回歸方程是IW=0.16462+0.24762T(n=450,R2=0.91865,P<0.01)。

圖1 鱸鯉微耳石上的熱標(biāo)記Fig. 1 Lapillus of P. pingi larvae, showing the thermal marks

表3 鱸鯉仔魚微耳石熱標(biāo)記輪的寬度Tab. 3 Increment widths of thermal marks on lapilli of P. pingi

2.2 AC熒光標(biāo)記

在綠光下, AC重復(fù)標(biāo)記的耳石均能觀察到2個(gè)橘紅色的標(biāo)記環(huán)(圖2); 在同樣的標(biāo)記條件下, 微耳石的標(biāo)記質(zhì)量最高, 矢耳石次之, 星耳石標(biāo)記質(zhì)量較低且不穩(wěn)定(圖3); 在可見(jiàn)光下, 能觀察到微耳石上的熱標(biāo)記特征輪紋(圖2)。方差分析(Three-way-ANOVA: 只考慮主效應(yīng), 事后檢驗(yàn)LSD)顯示, 標(biāo)記質(zhì)量受AC濃度影響顯著(P<0.05), 微耳石、矢耳石和星耳石間的標(biāo)記質(zhì)量差異顯著(P<0.05), 不過(guò), 標(biāo)記質(zhì)量受鱸鯉全長(zhǎng)的影響不顯著(P=0.217; 表4)。在首次標(biāo)記時(shí), 與對(duì)照組相比, AC標(biāo)記的鱸鯉死亡率極低。再次標(biāo)記時(shí), 則沒(méi)有出現(xiàn)死亡(表5)。

表4 AC標(biāo)記鱸鯉的標(biāo)記質(zhì)量方差分析Tab. 4 The results of ANOVA test on mark quality of P. pingi marked by AC

表5 AC標(biāo)記鱸鯉的死亡率Tab. 5 Mortality of P. pingi marked by AC (%)

圖2 AC標(biāo)記的鱸鯉微耳石Fig. 2 Lapillus of P. pingi marked by AC

2.3 ARS熒光標(biāo)記

在綠光下, ARS重復(fù)標(biāo)記的耳石均能觀察到兩個(gè)橘紅色標(biāo)記環(huán)(圖4); 在同樣的標(biāo)記條件下, 微耳石、矢耳石和星耳石的標(biāo)記質(zhì)量都很高, 均≥4(圖3);在可見(jiàn)光下, 能觀察到微耳石上的熱標(biāo)記特征輪紋(圖4)。方差分析(Three-way-ANOVA: 只考慮主效應(yīng), 事后檢驗(yàn)LSD)結(jié)果顯示, 標(biāo)記質(zhì)量受全長(zhǎng)和ARS濃度影響不顯著(P>0.05), 微耳石、矢耳石和星耳石間的標(biāo)記質(zhì)量差異顯著(P<0.05; 表6)。

表6 ARS標(biāo)記鱸鯉的標(biāo)記質(zhì)量方差分析Tab. 6 The results of ANOVA test on mark quality of P. pingi marked by ARS

圖3 AC和ARS標(biāo)記鱸鯉的標(biāo)記質(zhì)量Fig. 3 Mark quality of P. pingi marked by AC and ARS

圖4 ARS標(biāo)記的鱸鯉微耳石Fig. 4 Photographs of lapullus of P. pingi marked by ARS

在首次標(biāo)記時(shí), 與對(duì)照組相比, ARS標(biāo)記的鱸鯉死亡率極低。重復(fù)標(biāo)記時(shí), 使用200 mg/L濃度的組出現(xiàn)了高達(dá)75%的死亡率, 其他濃度組則沒(méi)有出現(xiàn)死亡(表7)。

表7 ARS標(biāo)記鱸鯉的死亡率Tab. 7 Motalities of P. pingi marked by ARS (%)

3 討論

3.1 鱸鯉耳石標(biāo)記的合適條件

魚類耳石標(biāo)記的安全性是人們非常關(guān)注的問(wèn)題。熱標(biāo)記通過(guò)人為調(diào)控胚胎或仔魚飼養(yǎng)水體在“高溫”和“低溫”之間周期性地交替來(lái)實(shí)現(xiàn)[15]?！案邷亍焙汀暗蜏亍辈粌H要在魚類正常承受范圍之內(nèi), 而且其差值及處理時(shí)間也要合適[15,16]。在一般情況下, 高低溫之差不低于2℃, 處理時(shí)間4h以上, 耳石上就能形成較為明顯的輪紋[15]。在自然水域中, 由于早期生活史階段往往經(jīng)歷著水溫晝夜劇烈變化等惡劣的水文條件, 魚類自身應(yīng)已經(jīng)具備相應(yīng)的抵御能力[17]。在本研究中, 標(biāo)記的高低溫之差達(dá)10℃,魚苗游動(dòng)、攝食等活動(dòng)正常, 也沒(méi)有死亡發(fā)生, 微耳石上形成的輪紋非常規(guī)律且清晰。不過(guò), 僅僅形成清晰的輪紋還不夠, 熱標(biāo)記輪紋還必須與自然形成的輪紋區(qū)別明顯。在實(shí)際觀察中發(fā)現(xiàn), 高溫期12h形成的輪紋, 容易與自然水溫波動(dòng)形成的輪紋混淆, 24h以上的高溫期處理形成的輪紋更寬則不易混淆, 也更容易在顯微鏡下快速識(shí)別。但高溫處理時(shí)間越長(zhǎng), 則越容易因溫度異常波動(dòng)形成非目的輪紋, 不利于標(biāo)記識(shí)別。根據(jù)本研究的結(jié)果, 熱標(biāo)記鱸鯉的高溫期處理時(shí)長(zhǎng)以24—72h為宜。

人們對(duì)耳石標(biāo)記技術(shù)的擔(dān)憂主要源于熒光標(biāo)記。研究表明, 熒光染料對(duì)魚體有一定毒性,在浸泡過(guò)程中魚體會(huì)出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng), 造成機(jī)體損傷, 甚至死亡[18—20]。熒光染料對(duì)魚體造成的機(jī)體損傷(尤其是死亡率), 受熒光染料的種類、濃度、浸泡時(shí)間、魚類種類和魚體規(guī)格等多種因素的影響, 但標(biāo)記質(zhì)量也同時(shí)受到這些因素的影響[9]。在一般情況下, 標(biāo)記造成的死亡率和標(biāo)記質(zhì)量隨著熒光染料溶液濃度的增加和浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而上升, 隨著魚體規(guī)格的增長(zhǎng)而降低[11]。本研究結(jié)果也基本與此相符。因而, 熒光標(biāo)記在早期生長(zhǎng)階段標(biāo)記質(zhì)量最佳,但此時(shí)魚體也最為脆弱, 需謹(jǐn)慎地選擇標(biāo)記條件,以減少魚體損傷。

在本研究中, 用AC和ARS首次標(biāo)記鱸鯉時(shí), 均出現(xiàn)不同程度死亡, 意外的是對(duì)照組死亡率也很高。檢查死亡魚體發(fā)現(xiàn)了大量斜管蟲, 寄生蟲會(huì)造成魚體抵抗力下降, 這可能是各組死亡率異常升高的真正原因。因此, 本研究認(rèn)為溶液濃度不高于200 mg/L、浸泡時(shí)間不高于24h時(shí), AC和ARS對(duì)鱸鯉早期魚苗影響較小, 標(biāo)記質(zhì)量也很高。在稀有鯽(Gobiocypris rarus)[21]、胭脂魚[13]、滇池金線鲃(Sinocyclocheilus grahami)[22]和唐魚(Tanichthys albonubes)[23]等魚類的標(biāo)記研究中, 較為安全的標(biāo)記濃度多為50—150 mg/L?；魜?lái)江[20]在研究ARS標(biāo)記中華倒刺鲃?dòng)佐~時(shí)發(fā)現(xiàn), 低濃度的ARS會(huì)激活機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng), 對(duì)魚體造成的損傷能夠得到很快恢復(fù), 濃度過(guò)高則發(fā)生抑制作用且很難恢復(fù)。在本研究中, 使用相同的條件于10d后再次標(biāo)記鱸鯉時(shí)(魚體已更為健壯), ARS溶液濃度200 mg/L的組出現(xiàn)了極高的死亡率。檢查死亡魚體并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)寄生蟲或其他明顯外部損傷。因此, 本研究認(rèn)為,200 mg/L的ARS溶液對(duì)鱸鯉早期魚苗造成的損傷需要較長(zhǎng)時(shí)間恢復(fù), 實(shí)際應(yīng)用時(shí)不應(yīng)高于這個(gè)濃度。由于大規(guī)模應(yīng)用時(shí), 魚體規(guī)格和健康程度不可能完全一致, 標(biāo)記條件適用性必須更為廣泛。結(jié)合短須裂腹魚等魚類的大規(guī)模標(biāo)記經(jīng)驗(yàn)[10], 本研究推薦AC或ARS標(biāo)記鱸鯉早期魚苗的合適條件為: 溶液濃度50—100 mg/L, 浸泡時(shí)間24h。這樣既可以保證標(biāo)記效果, 又不會(huì)對(duì)魚體造成明顯負(fù)面影響。

3.2 ARS和AC在耳石熒光標(biāo)記中的應(yīng)用前景分析

在本研究中, 使用AC和ARS溶液第一次標(biāo)記鱸鯉時(shí), 各處理組死亡率都較低(ARS組略高于AC組), 但10d之后再次標(biāo)記時(shí), AC組均沒(méi)有出現(xiàn)死亡, ARS 溶液200 mg/L這組卻出現(xiàn)了75%的死亡率。這表明AC對(duì)鱸鯉早期魚苗毒性比ARS低一些。Beckman和Schulz[24]標(biāo)記白胭脂魚(Catostomus commersoni)和另外2種鯉科魚類(Campostoma anomalum和Phoxinus erythrogaster)也有著相似的結(jié)果。趙亞鵬等[22]對(duì)滇池金線鲃的研究卻顯示,ARS組的死亡率明顯低于AC組。ARS和AC在不同魚類中表現(xiàn)出的毒性差異, 可能是物種等因素造成的[9]。不過(guò), 這2種熒光染料在合適的條件下均是相對(duì)低毒的。本研究還發(fā)現(xiàn), 在相同的條件下, 3種耳石的標(biāo)記質(zhì)量存在較大差異, 這可能是ARS和AC兩種熒光物質(zhì)被鱸鯉吸收并沉積在耳石上的速率不同造成的。總體上看, ARS標(biāo)記質(zhì)量明顯比AC高, 均為優(yōu)質(zhì)標(biāo)記。市場(chǎng)上AC價(jià)格較貴, 而ARS則便宜得多, 并且ARS也更易溶解于水中。因此, 使用低濃度的ARS浸泡鱸鯉早期魚苗是更經(jīng)濟(jì)和更具應(yīng)用前景的標(biāo)記方式[9]。

3.3 耳石熱標(biāo)記和熒光標(biāo)記的結(jié)合應(yīng)用

耳石熱標(biāo)記在鮭魚增殖放流中已有二十多年的大規(guī)模應(yīng)用歷史, 發(fā)展出了如莫爾斯碼[25]、條形碼[26]和“RBr”編碼[27]等多種熱標(biāo)記模式管理方法,實(shí)際可用的熱標(biāo)記模式大約有100種[28]。豐富的標(biāo)記模式不僅可以滿足區(qū)分不同放流時(shí)間、不同放流地點(diǎn)或者不同魚類增殖站等研究需求, 也有助于系統(tǒng)化的魚類標(biāo)記放流管理。不過(guò), 識(shí)別熱標(biāo)記時(shí)需要將耳石精確打磨成薄片。處理大小不一和形態(tài)多樣的耳石不僅非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力, 耳石在打磨時(shí)也很容易損壞, 而且識(shí)別熱標(biāo)記時(shí)還有著很高的錯(cuò)誤率[29,30]。Volk等[15]將耳石熱標(biāo)記識(shí)別錯(cuò)誤分為2個(gè)類型, 一是把沒(méi)有熱標(biāo)記的個(gè)體識(shí)別為有標(biāo)記, 二是把熱標(biāo)記模式錯(cuò)誤歸類, 但卻未給出很好的解決辦法。

熒光標(biāo)記的實(shí)施操作簡(jiǎn)單, 標(biāo)記識(shí)別容易, 甚至不需要打磨耳石[10,31]。但是, 熒光標(biāo)記可供選擇的標(biāo)記模式很少, 一般只能簡(jiǎn)單地增加標(biāo)記次數(shù)[8]。不過(guò), 標(biāo)記次數(shù)增加非常有限且存在毒性累積風(fēng)險(xiǎn)。一些學(xué)者曾將熒光標(biāo)記用于研究魚類耳石增長(zhǎng)[32]和日輪確證[33]。從另一個(gè)角度看, 這實(shí)際上是將熒光標(biāo)記和熱標(biāo)記結(jié)合了起來(lái)。在本研究中, 先后使用熱標(biāo)記和熒光標(biāo)記2種方法標(biāo)記鱸鯉早期魚苗, 2種標(biāo)記在耳石上均能清晰識(shí)別。2種標(biāo)記方法共同使用, 識(shí)別標(biāo)記時(shí), 就可以先將3對(duì)耳石中的1—2顆用于檢測(cè)是否存在熒光標(biāo)記。當(dāng)發(fā)現(xiàn)有熒光標(biāo)記時(shí), 再將其他耳石按熱標(biāo)記識(shí)別的方式處理。這樣不僅有助于減少打磨耳石的工時(shí)耗費(fèi), 提高工作效率, 還有助于避免把無(wú)熱標(biāo)記個(gè)體識(shí)別為有標(biāo)記, 同時(shí)還解決了熒光標(biāo)記模式較少的問(wèn)題,從而在一定程度上彌補(bǔ)單獨(dú)使用一種標(biāo)記方法的不足。