聶瑞雪，李俊英，苗歡歡，凌 遙，張 浩，吳常信

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院畜禽育種國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

精液冷凍（Semer Cryopreservation）是指新鮮精液經(jīng)過程序化處理后在液氮或其他冷源的輔助下迅速凝結(jié)的技術(shù)，精液冷凍使精子的生命活動(dòng)被抑制從而達(dá)到長期保存的目的。精液冷凍保存技術(shù)在家畜生產(chǎn)中迅速發(fā)展，目前奶牛精液冷凍保存應(yīng)用最為廣泛[1]，而豬[2]、綿羊[3]、馬[4]、雞[5]的精液冷凍保存技術(shù)尚未廣泛應(yīng)用，但近年來也取得了一定進(jìn)展。

雞精液冷凍研究最早始于1941 年，Shaffner 等[6]將雞精液于-6℃保存30 s 后進(jìn)行人工授精，成功孵化出1 只雛雞，這是世界上有文獻(xiàn)記載的第一只由冷凍處理后的精液受精孵化而來的雛雞。1949—1951 年，Polge[7-8]團(tuán)隊(duì)意外發(fā)現(xiàn)甘油在冷凍條件下（-79℃）對(duì)精子有保護(hù)作用，便開始將甘油添加到雞精液稀釋液中，最終成功孵化出35 只雛雞。隨后國內(nèi)外對(duì)雞精液稀釋液、冷凍保護(hù)劑、冷凍程序、解凍過程等技術(shù)環(huán)節(jié)展開了諸多研究。

精液冷凍技術(shù)對(duì)于家禽生產(chǎn)業(yè)發(fā)展和優(yōu)良種質(zhì)資源保護(hù)至關(guān)重要。隨著高通量測序和芯片技術(shù)的發(fā)展，全基因組選擇（Genome Selection，GS）作為新一代選育技術(shù)已經(jīng)逐漸應(yīng)用到奶牛[9-10]、豬[11]、山羊[12]等家畜的遺傳改良，在雞上的應(yīng)用也開始受到關(guān)注[13-14]。穩(wěn)定、高效的雞精液冷凍保存可以大幅降低GS 中飼養(yǎng)公雞的成本，加快育種進(jìn)展[15]。利用雞精液冷凍技術(shù)還可以建立遺傳資源基因庫，保護(hù)瀕臨滅絕的珍稀禽類以及地方特色禽類品種。

目前，雞精液冷凍保存解凍后的精子活力、受精率、保存時(shí)間等指標(biāo)均不理想。雞精液冷凍技術(shù)仍處于研究階段，未能在生產(chǎn)中應(yīng)用[5]，還需結(jié)合其精液特點(diǎn)和精子結(jié)構(gòu)，優(yōu)化冷凍體系，建立一套兼具高受精率和高穩(wěn)定性的冷凍保存程序，為基因組選擇在家禽中的順利應(yīng)用和珍稀禽類遺傳資源的保護(hù)提供保障。本文概述國內(nèi)外關(guān)于雞精液冷凍的最新研究進(jìn)展，分析雞精液冷凍程序中存在的諸多問題，為今后的研究提供參考。

1 雞精子結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)

與哺乳動(dòng)物的精子相比，雞的精子對(duì)于低溫冷凍更加敏感。同樣采用人工授精，冷凍雞精液的受精能力顯著低于鮮精液，新鮮精液的受精率可達(dá)90%，而冷凍后精液的受精率僅在55%左右[5,16]。凍融降低雞精子受精能力的原因尚不完全清楚，可能與其獨(dú)特的細(xì)胞形態(tài)和生理特征有關(guān)。

1.1 雞精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)易受冷凍損傷 不同物種的精子形態(tài)存在一定差異，但結(jié)構(gòu)上具有共性，均由頭部、頸段和尾部組成。雞精子頭部整體呈長圓柱形，頂端為錐形（圖1）[17-19]。雞精子細(xì)絲狀的尾部由頸段與頭部相連，頭部的寬度與尾部沒有明顯差別，與公牛的精子頭部相比，雞精子頭部的容積更?。▓D2）。在進(jìn)行冷凍操作中，雞精子頭部能夠容納的冷凍保護(hù)劑十分有限，因此冷凍保護(hù)劑對(duì)雞精子的保護(hù)效果低于哺乳動(dòng)物。Villaverde-Morcillo[17]測量了雞精子頭部的尺寸，長度為（13.5±3.5）μm，寬度為（1.3±1.7）μm，雞精子除了頭部以外的長度可達(dá)90 μm[21]。與其他物種相比，雞精子的尾部更長，在冷凍、解凍的過程中更容易受到損傷，尾部斷裂的精子無法進(jìn)行游動(dòng)，這也是經(jīng)冷凍后解凍的精子受精率低的原因之一[22]。

圖1 顯微鏡下的雞精子[17]（Hemacolor 法染色）

圖2 不同物種的精子示意圖[20]

1.2 雞精子的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)易受冷凍損傷 前人[22]研究結(jié)果表明，凍融操作也會(huì)導(dǎo)致精子膜結(jié)構(gòu)的損傷，主要表現(xiàn)在精子頸段產(chǎn)生畸形。新鮮雞精液的頸段畸形率只有0.9%，受精率為85.9%，而經(jīng)過低溫冷凍的精子頸段畸形率達(dá)到49.1%，受精率僅有46.8%[23]。Olexikova[24]利用透射電鏡評(píng)估新鮮雞精子和冷凍后解凍雞精子的漿膜和頂體外觀，根據(jù)質(zhì)膜的狀態(tài)將精子分為3 個(gè)等級(jí)（圖3）。一級(jí)的精子質(zhì)膜完整且頂體后部稍有腫脹，二級(jí)是頂體和頂體后部均出現(xiàn)腫脹，三級(jí)的精子質(zhì)膜已經(jīng)完全遭到破壞，頂體與精子頸發(fā)生分離。研究表明，鮮精中有87% 的精子屬于一級(jí)，而冷凍后解凍的精子只有約25% 的精子屬于一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)的精子占絕大部分[24]。因此，冷凍保存會(huì)導(dǎo)致雞精子發(fā)生不同程度的漿膜和頂體損傷，頂體的缺失可能是凍存雞精子受精能力下降的又一主要原因。

圖3 透射電鏡下的雞精子，（a）（b）（c）分別代表一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)精子[24]

1.3 雞精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)易受氧化損傷 精液冷凍過程中的凍融操作會(huì)改變精子環(huán)境的滲透壓，而精子質(zhì)膜的成分和質(zhì)膜的流動(dòng)性是適應(yīng)滲透變化必不可少的因素[25-26]。精子質(zhì)膜由脂質(zhì)、膽固醇和蛋白質(zhì)組成，質(zhì)膜中還有很高比例的不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acid，PUFA）?；钚匝酰≧eactive Oxygen Species，ROS）是組織進(jìn)行正常有氧代謝的天然產(chǎn)物，可以維持細(xì)胞內(nèi)的正常功能。當(dāng)精子受到冷凍保存等外源刺激時(shí)，其產(chǎn)生大量的ROS 會(huì)誘導(dǎo)質(zhì)膜上的PUFA 發(fā)生過氧化反應(yīng)（Lipid Peroxidation，LPO），從而損傷精子質(zhì)膜[27]。由于雞精子質(zhì)膜的成分特點(diǎn)，與哺乳動(dòng)物相比雞精子更易發(fā)生LPO，導(dǎo)致精子內(nèi)線粒體膜和細(xì)胞膜的損壞，胞內(nèi)酶滲漏，DΝA 片段損傷，精卵融合困難，最終表現(xiàn)為解凍后精子活力降低，受精率低[28]。為降低ROS對(duì)雞精子的冷應(yīng)激，研究人員在精液稀釋中添加超氧化物歧化酶[29]、過氧化氫酶[30]、維生素E[31]、褪黑激素[32]、白藜蘆醇[33]等抗氧化劑來保護(hù)精子，且取得了一定的效果。

精子質(zhì)膜流動(dòng)性與質(zhì)膜成分有關(guān)，其有助于精子解凍后膜生理狀態(tài)的修復(fù)，是預(yù)測精子耐冷凍能力的可靠指標(biāo)[34]。研究質(zhì)膜流動(dòng)性的常規(guī)技術(shù)是熒光探針法，將熒光探劑（如1,6 -diphenyl-1,3,5-hexatriene）與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合，以形成發(fā)光的絡(luò)合物再進(jìn)行檢測，熒光強(qiáng)度越大，細(xì)胞質(zhì)膜的流動(dòng)性就越小[34]。Blesbois 等[35]研究表明，測得熒光值越低，雞精子質(zhì)膜的流動(dòng)性越高，凍后精子畸形或死亡的數(shù)目越少，說明精子質(zhì)膜流動(dòng)性與精子抗凍相關(guān)，是精子在凍融后恢復(fù)活力并維持受精能力的可靠預(yù)測因子。

2 雞精液冷凍保存優(yōu)化技術(shù)方案研究

針對(duì)雞精子特點(diǎn)，結(jié)合精液冷凍環(huán)節(jié)的原理，研究人員在優(yōu)化雞精液冷凍技術(shù)方面積極開展研究，包括冷凍保護(hù)劑種類[36]、冷凍保護(hù)劑濃度優(yōu)化[37]、冷凍速率優(yōu)化[38]、添加抗氧化劑[38]，以及不同的冷凍劑型[39]。筆者整理了近年來關(guān)于雞精液研究的結(jié)果，詳見表1。

表1 近年來關(guān)于雞精液冷凍研究的報(bào)道

2.1 雞精液冷凍保護(hù)劑的研究 雞精液冷凍最常用的冷凍保護(hù)劑是甘油和二甲基乙酰胺（DMA）[40]。甘油常用來制作0.25 mL 的細(xì)管凍精，具有易標(biāo)記和管理方便的優(yōu)點(diǎn)，但是甘油具有生殖毒性，在授精之前要通過離心法來降低甘油對(duì)精卵結(jié)合的影響[41]。DMA 用來制作凍精顆粒的效果比較好，省去了在人工授精之前離心去掉保護(hù)劑的步驟，但由于顆粒凍精不便于標(biāo)記，不適用于需要區(qū)別雞個(gè)體的情況。Wu[37]在研究中同時(shí)考慮甘油濃度（2%、4%、6%、8%、11%）和冷凍速率對(duì)雞精液受精能力的影響，結(jié)果顯示，凍精細(xì)管距離液氮表面6 cm 時(shí)解凍后精子活率最高，各甘油濃度梯度的精子活率分別是57%、70%、70%、82%、82%，說明甘油濃度越高，對(duì)精子的保護(hù)效果越好，凍融之后的活率越好；但后續(xù)用清洗-離心法去甘油后進(jìn)行深陰部人工授精，各甘油濃度保護(hù)精液的種蛋受精率分別為34.8%、75.1%、77.6%、70.0%、57.4%，入孵蛋孵化率分別為26.2%、71.4%、73.3%、69.4%、55.6%。這可能是因?yàn)楦邼舛雀视捅Ｗo(hù)時(shí)，脫甘油會(huì)對(duì)精子造成傷害，少量殘余的甘油會(huì)阻礙精子向受精部位游動(dòng)，從而影響受精率。Wu[37]研究結(jié)果中的77.6%受精率是目前冷凍雞精液達(dá)到的較高水平，但該研究中精液冷凍保存時(shí)間較短，人工授精頻率高，且采用深陰部授精，很難在雞生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

2.2 抗氧化劑的研究 在精液稀釋液中添加抗氧化劑可以防止雞精子遭受氧化損傷。常用于雞精液的抗氧化劑有過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶，以及維生素E、維生素C、褪黑激素、番茄紅素、硒、鋅等[42]。褪黑激素因其對(duì)自由基有清除作用被廣泛認(rèn)為是一種有效的抗氧化劑，可以保護(hù)細(xì)胞的完整，維持細(xì)胞功能[43]。Mehaisen[32]將一定濃度的褪黑激素添加到稀釋液中，解凍后的雞精子活率為34.7%，空白對(duì)照組為25.3%。Appiah[44]將褪黑激素作為抗氧化劑，結(jié)果顯示解凍后的雞精子活率為39.67%，空白對(duì)照組為32.33%。目前的研究結(jié)果還不足以說明褪黑激素對(duì)解凍后精子的受精能力有保護(hù)作用，但通過研究可以發(fā)現(xiàn)，褪黑激素可以促進(jìn)自由基在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)和在線粒體內(nèi)的積累，從而達(dá)到保證膜完整性和線粒體具有活力的目的[44]。線粒體活力正?？梢员３帜芰康恼９?yīng)，為精子提供解凍后的能量來源。因此褪黑激素對(duì)精子細(xì)胞膜的有益作用可以積極地反映在精子功能和活力[45]。

2.3 精液稀釋液的研究 雞精液密度高、黏性大，理想的精液稀釋液可以為精子的代謝活動(dòng)提供能量，維持pH 和滲透壓的穩(wěn)定，保障精子生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。Thananurak[46]用泰國本地雞作為研究對(duì)象，比較了3種雞精液冷凍稀釋液對(duì)解凍后精子活率和受精率的影響結(jié)果顯示，采用布盧姆貝格爾稀釋液（BHSV-based Extender）的精子解凍后活率為68.83%，使用Sasaki稀釋液（Sasaki Extender）的解凍后活率為68.50%，TΝC 稀釋液（Thai Νative Chicken Extender，TΝC）的解凍后活率是66.33%，將解凍后精液進(jìn)行人工授精，受精率分別為73.37%、77.27%、90.27%，但該研究中用于人工授精的母雞數(shù)較少（12 只），冷凍保存時(shí)間不明確，對(duì)于新的稀釋液效果和穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步研究。

精液稀釋液還可以承載抗氧化劑和冷凍保護(hù)劑，貝茲維爾稀釋液[47]（Beltsville Extender）和雷克稀釋液[48]（Lake Extender）應(yīng)用較為廣泛，分別添加抗氧化劑蝦青素[47]和谷胱甘肽[48]可以提高精子的抗氧化能力，解凍后的活率分別為68.6%、58.8%。納比稀釋液（Νabi Extender）是一種新型稀釋液，Νabi[49]對(duì)比發(fā)現(xiàn)，用納比稀釋液處理的精液解凍后活率為65.4%，效果優(yōu)于傳統(tǒng)的貝茲維爾稀釋液。理想的精液稀釋液會(huì)保護(hù)精子免受冷凍損傷和氧化應(yīng)激，保持精子質(zhì)膜的完整性，使精子保持良好的解凍后受精水平。

3 展 望

雞精液冷凍保存對(duì)于家禽業(yè)的生產(chǎn)和遺傳多樣性的保存具有至關(guān)重要的意義，但是雞精液冷凍技術(shù)目前不能用于生產(chǎn)實(shí)踐。在過去的幾十年里，雞精液冷凍技術(shù)取得了一定的進(jìn)展，但沒有建立一套規(guī)范的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。雞精液進(jìn)行冷凍目的是對(duì)精子進(jìn)行長期保存，但目前的研究鮮有對(duì)冷凍時(shí)間進(jìn)行記錄，對(duì)保存時(shí)長的研究還不夠重視。未來的研究中應(yīng)該側(cè)重?zé)o毒無害冷凍保護(hù)劑的挖掘，細(xì)化冷凍保護(hù)劑和抗氧化劑對(duì)精子不同部位的保護(hù)作用，精子抗凍性的機(jī)制研究，以期得到保護(hù)作用全面、沒有生殖毒性、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的綜合雞精液稀釋液，從而進(jìn)一度提高雞精液冷凍水平，早日用于生產(chǎn)實(shí)踐。