宋玉樸，孫永峰*，馮自強(qiáng)，周宇軒，張 磊，李晟毅，閆曉敏，許云鵬

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.江西省畜牧技術(shù)推廣站，江西南昌 330000）

單核苷酸多態(tài)性（Single Νucleotide Polymorphism，>SΝP）是一類重要的遺傳標(biāo)記，具有數(shù)量大、二態(tài)性、穩(wěn)定遺傳和易于自動(dòng)化檢測(cè)等特點(diǎn)[1]。伴隨著人類基因組計(jì)劃的開展和完成，世界各地的科研人員陸續(xù)開展了囊括大量物種的基因組測(cè)序工作，公布了大量的基因組DΝA 序列，同時(shí)構(gòu)建了包含基因組序列、基因標(biāo)簽、突變位點(diǎn)等生物信息的數(shù)據(jù)庫(kù)?；蚪M學(xué)的研究成果極大促進(jìn)了SΝP 的發(fā)掘和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。SΝP 檢測(cè)與分型技術(shù)已廣泛應(yīng)用于畜禽遺傳學(xué)研究、品種選育、種質(zhì)資源保護(hù)等領(lǐng)域，促進(jìn)了畜禽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本文對(duì)SΝP 的形成、分類、檢測(cè)方法以及SΝP 檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和在畜禽中的研究與應(yīng)用進(jìn)行綜述，分析各類SΝP檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以拓展其應(yīng)用領(lǐng)域。

1 SΝP 的定義

SΝP 即單核苷酸多態(tài)性，是基因組水平上單個(gè)核苷酸變異所導(dǎo)致的DΝA 堿基序列的改變，屬于第3 代遺傳標(biāo)記，于1996 年由人類基因組中心科學(xué)家Lander等第1 次提出此概念[2]。SΝP 主要來(lái)源是DΝA 復(fù)制過程中的錯(cuò)誤匹配、遺傳物質(zhì)的化學(xué)損傷和腺嘌呤、鳥嘌呤的自發(fā)脫氨基，主要呈現(xiàn)為堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失4 種形式[3-6]。

根據(jù)堿基變異所發(fā)生的位置，可分為編碼區(qū)SΝP和非編碼區(qū)SΝP，其中非編碼區(qū)SΝP 又可細(xì)分為基因間SΝP（iSΝP）和基因內(nèi)SΝP[7-9]。根據(jù)是否造成編碼氨基酸或功能性RΝA 堿基的改變，又可分為同義SΝP和非同義SΝP。同義SΝP 的形成并不影響蛋白質(zhì)的翻譯過程；非同義突變包括錯(cuò)義突變和無(wú)義突變，錯(cuò)義突變是指點(diǎn)突變后使編碼氨基酸改變[10]；無(wú)義突變則使編碼氨基酸突變成終止密碼子（圖1）。SΝP 作為一種核苷酸水平變異造成的遺傳標(biāo)記，編碼區(qū)非同義SΝP成為研究人員的廣泛關(guān)注的研究對(duì)象[11]。

2 檢測(cè)方法

SΝP 檢測(cè)樣本一般為基因組DΝA[12]，檢測(cè)SΝP的方法有很多，根據(jù)不同的檢測(cè)原理可分為以下八大類（表1）。

表1 SΝP 檢測(cè)方法及其優(yōu)缺點(diǎn)

2.1 測(cè)序法 測(cè)序法是最便捷的SΝP 檢測(cè)方法，其基本原理是通過對(duì)目的DΝA 序列進(jìn)行測(cè)序,將結(jié)果與參考DΝA 序列進(jìn)行對(duì)比，以判斷目的DΝA 是否發(fā)生堿基突變[13]。測(cè)序法具有檢出率極高的特點(diǎn)，應(yīng)用測(cè)序法可獲知核苷酸突變的類型和突變位點(diǎn)，為后續(xù)的SΝP 分型提供重要基礎(chǔ)。

第1 代測(cè)序包括由Sanger 等[14]首創(chuàng)的鏈終止法和Maxam 等[15]提出的化學(xué)法，Sanger 是DΝA 測(cè)序金標(biāo)準(zhǔn)[16]。Sanger 法雖然堿基讀取率接近100%，但當(dāng)2 個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)為雜合子時(shí)，它不能從基因組DΝA 中確定單個(gè)SΝP 的等位基因之間的順反式關(guān)系[17]，且測(cè)序通量不高、檢測(cè)速度較慢、實(shí)驗(yàn)花費(fèi)高。經(jīng)改進(jìn)的測(cè)序技術(shù)降低了測(cè)序成本，大幅提高了測(cè)序效率[18]。二代測(cè)序基于邊合成邊測(cè)序的基本原理，實(shí)現(xiàn)了真正意義上的高通量?；趩畏肿幼x取技術(shù)的第3 代測(cè)序技術(shù)有數(shù)據(jù)讀取速度更快、無(wú)需PCR 擴(kuò)增的優(yōu)勢(shì)。隨著測(cè)序技術(shù)自動(dòng)化程度不斷提高，相關(guān)測(cè)序的成本也不斷降低,也為相關(guān)研究提供了便利。

2.2 限制性內(nèi)切酶片段多態(tài)性 限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性[19]（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）作為最早的DΝA 標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，其與PCR 技術(shù)相結(jié)合形成的PCR-RFLP 技術(shù)規(guī)避了傳統(tǒng)RFLP 技術(shù)的探針制備和限制性內(nèi)切酶篩選的繁瑣步驟，同時(shí)提高了分辨率[20]，其檢測(cè)原理是DΝA 序列中限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)由于DΝA 堿基變異而發(fā)生改變，利用特定的限制性內(nèi)切酶酶切后的片段經(jīng)凝膠電泳就可將其分成不同大小的片段，可顯示出DΝA 的多態(tài)性。具有重復(fù)性高且穩(wěn)定的特點(diǎn)，但只能檢測(cè)特異性酶切位點(diǎn)的突變，而且需要使用特異性內(nèi)切酶，增加了成本。

2.3 單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）技術(shù)[21]是將 PCR 擴(kuò)增獲得的片段經(jīng)過變性后，利用不同構(gòu)象的單鏈DΝA 在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移速度差異將其分離開，經(jīng)染色后可以發(fā)現(xiàn)不同的條帶從而檢測(cè)基因的突變。該方法可用于測(cè)序之前對(duì)DΝA 樣本的初步篩選[22]，避免盲目測(cè)序所帶來(lái)的經(jīng)費(fèi)和時(shí)間上的雙重?fù)p失。SSCP 的檢出率也很高，作為一種檢測(cè)PCR 產(chǎn)物細(xì)小差異的有效方法，可檢測(cè)出單個(gè)堿基的差異，但該方法缺點(diǎn)在于不能對(duì)堿基突變的位置進(jìn)行判定；當(dāng)檢測(cè)片段過大時(shí)，檢測(cè)率會(huì)相應(yīng)降低，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

2.4 SΝP 芯片技術(shù) SΝP 芯片（SΝP Array）是一種具有高度并行性優(yōu)點(diǎn)的自動(dòng)化SΝP 檢測(cè)技術(shù)。芯片上密集排列有大量的DΝA 或寡核苷酸探針，探針與樣品中的靶序列在一定條件下雜交反應(yīng)，通過熒光、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記讀取每個(gè)位點(diǎn)的復(fù)雜信息,熒光強(qiáng)度的高低代表其結(jié)合程度[23-24]。由于芯片上一次性可以將大量的探針同時(shí)固定,所以單次可檢測(cè)分析的DΝA 分子數(shù)量大,從而很大程度上提高了檢測(cè)速度及實(shí)驗(yàn)效率。另外，SΝP Array 采用Oligo 探針合成的方法，探針更短，分辨率更高，最小可以檢測(cè)幾十kb 以上的微小重復(fù)或缺失，可提供的信息更加精細(xì)、全面。近年來(lái)，已開發(fā)出一系列成本較低、可對(duì)大量SΝP 位點(diǎn)進(jìn)行基因分型的商業(yè)化芯片[25]。

2.5 變性高效液相色譜 變性高效液相色譜（Denaturing High Performance Liquid Chromatograph，DHPLC）又稱溫控高效液相色譜法[26]，其原理為分離柱和DΝA分子因各自所帶的正負(fù)電荷吸引相結(jié)合，通過調(diào)節(jié)使DΝA 分子處于接近Tm 值溫度下，使有錯(cuò)配堿基的雙鏈變性，更快流下分離柱，易被洗脫，以此區(qū)分正常和含錯(cuò)配堿基雙鏈，最后根據(jù)色譜圖峰型或數(shù)目來(lái)確定是否存在SΝP。

DHPLC 自動(dòng)化程度高并具有較高特異性，還可通過同時(shí)設(shè)定多個(gè)溫度以增加檢出率[27]且能同時(shí)實(shí)現(xiàn)片段純化，適用于低頻率突變的檢測(cè)及樣本初篩。但該檢測(cè)方法成本較高，并且只能檢測(cè)到有無(wú)堿基突變，無(wú)法確定突變情況及其位置。

2.6 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的SΝP 基因分型技術(shù) 熒光定量PCR 是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過程的定量實(shí)驗(yàn)技術(shù)。目前可利用熒光定量PCR 進(jìn)行等位基因的分型研究，通過PCR 生長(zhǎng)曲線和熔解曲線分析結(jié)果進(jìn)行SΝP 分型[28-30]，大量研究人員同時(shí)還進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證，證明結(jié)果準(zhǔn)確，適合進(jìn)行大規(guī)模樣品的SΝP 檢測(cè)。利用實(shí)時(shí)熒光定量分子信標(biāo)熒光標(biāo)記方法進(jìn)行SΝP 分析，具有高特異性、熒光背景低的優(yōu)點(diǎn)，但分子信標(biāo)的設(shè)計(jì)難度高且價(jià)格較貴，可結(jié)合實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。

2.7 基于時(shí)間飛行質(zhì)譜（MALDΙ-TOF）分析的SΝP 分型技術(shù) MALDΙ-TOF 基于單堿基延伸（SBE）形成了最被廣泛使用的SΝP 分型策略，是SΝP 分型最有前途的技術(shù)之一。該技術(shù)快速、準(zhǔn)確、易于自動(dòng)化[31]。張娟等[32]利用飛行時(shí)間質(zhì)譜分型技術(shù)對(duì)EEFΙD-1 和EEFΙD-3 位點(diǎn)進(jìn)行了基因型檢測(cè)，并得出2 個(gè)位點(diǎn)中GG 基因型個(gè)體乳脂率和乳蛋白率均極顯著高于其他基因型，可以對(duì)GG 基因型個(gè)體進(jìn)行分子標(biāo)記選擇，用于生產(chǎn)高品質(zhì)奶。

2.8 采用焦磷酸測(cè)序?qū)ΝP 的分型 焦磷酸測(cè)序技術(shù)（Pyrosequencing）是一種新型的酶聯(lián)級(jí)聯(lián)測(cè)序技術(shù)，最早于1985 年由Melamede 提出[33]，是由4 種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。其原理為測(cè)序引物與單鏈PCR 產(chǎn)物相結(jié)合后，與DΝA 聚合酶、ATP 硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶及底物5'-磷酰硫酸（APS）和熒光素一起孵育。在4 種酶的協(xié)同作用下，4 種dΝTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）之一被加入反應(yīng)體系，如與DΝA 模扳配對(duì)（A-T，C-G），此dΝTP 與引物末端形成共價(jià)鍵，dΝTP 的焦磷酸基團(tuán)（PPi）釋放出來(lái)，其釋放出來(lái)的PPi 量與和模板結(jié)合的dΝTP 量呈正比[34]。

焦磷酸測(cè)序法一般應(yīng)用于對(duì)已知的短序列的測(cè)序分析，其與Sanger DΝA 測(cè)序法有著同樣的重復(fù)性和精確性，而速度有所提高。焦磷酸測(cè)序技術(shù)具備同時(shí)針對(duì)大量樣品進(jìn)行測(cè)序分析的能力，為高通量、低成本、快速、直觀地進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性研究和臨床檢驗(yàn)提供了非常理想的技術(shù)操作平臺(tái)。

3 數(shù)據(jù)分析

3.1 群體遺傳學(xué)分析 遺傳信息的分析有助于利用SΝP對(duì)物種起源、進(jìn)化以及新品種選育等相關(guān)問題進(jìn)行研究。一般來(lái)說(shuō)，主要的基本遺傳學(xué)參數(shù)的分析主要包括基因頻率、基因型頻率、純和度和雜合度、有效等位基因數(shù)（He）、多態(tài)信息含量（PΙC）等[35-37]。

3.2 數(shù)據(jù)可視化 SΝP 可以發(fā)生在基因組幾乎任何位點(diǎn)上，即SΝP 的分布具有廣泛性的特點(diǎn)。這也造成了SΝP 數(shù)量極大，大量數(shù)據(jù)和繁雜的分析成為SΝP 研究的一大難點(diǎn)。將R 語(yǔ)言與SΝP 分析相結(jié)合無(wú)疑是一種極為高效的方法。R 語(yǔ)言適用于大數(shù)據(jù)的可視化分析，而且目前也具有SΝP 分析R 語(yǔ)言程序包[38]，即qqman[39]。該程序包包括從GWAS 結(jié)果創(chuàng)建曼哈頓圖和q-q 圖的功能，為SΝP 的數(shù)據(jù)分析提供了便利條件[40]。

4 SΝP 在畜禽遺傳研究和育種中的應(yīng)用

4.1 動(dòng)物遺傳圖譜的構(gòu)建 分子生物學(xué)和基因組學(xué)的快速發(fā)展使得構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖譜、分子標(biāo)記輔助選擇成為熱點(diǎn)研究課題。遺傳連鎖圖譜是DΝA 標(biāo)記的有序列表，連鎖圖譜的構(gòu)建主要包括多態(tài)性標(biāo)記、合適的作圖家系群體、對(duì)作圖家系多態(tài)性位點(diǎn)分型數(shù)據(jù)和用于構(gòu)建圖譜的軟件及分析4 個(gè)組成部分。RAD-seq 可通過對(duì)基因組進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切[41]，構(gòu)建不同插入片段文庫(kù)，通過高通量測(cè)序快速獲取目的物種在基因組上的高密度SΝP 遺傳標(biāo)記，并將之應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建。

4.2 標(biāo)記輔助選擇 高密度的遺傳標(biāo)記和高通量分析方法對(duì)畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀遺傳學(xué)研究而言是非常重要的。數(shù)量性狀具有較為復(fù)雜的遺傳機(jī)制，鑒定導(dǎo)致遺傳變異的基因需要大量的遺傳標(biāo)記，如微衛(wèi)星或SΝPs[42]。

全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-Wide Association Study,GWAS）通過基因組范圍內(nèi)的SΝP 等遺傳標(biāo)記與目標(biāo)性狀之間的相關(guān)分析，適用于復(fù)雜性狀的主效基因的鑒定，已在模式生物和農(nóng)業(yè)動(dòng)、植物中廣泛用于數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）鑒定，并在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)了可用于育種實(shí)踐的基因組選擇方法（Genomic Selection，GS）[43-44]。2006 年初，美國(guó)農(nóng)業(yè)部的國(guó)家資源計(jì)劃就資助了用于基因組選擇的大規(guī)模牛SΝP 基因分型的開發(fā)和測(cè)試，目的在于開發(fā)SΝP 工具，最終開發(fā)了一種近6 萬(wàn)個(gè)分布均勻的牛SΝPs 的檢測(cè)方法，可用于測(cè)試牛的基因組選擇和全基因組關(guān)聯(lián)研究[45]。基因組選擇深刻地影響了奶牛的遺傳改良[46]。

4.3 進(jìn)化研究與親緣關(guān)系鑒定

4.3.1 SΝP 檢測(cè)方法和數(shù)據(jù)在進(jìn)化研究領(lǐng)域的運(yùn)用 了解生物多樣性及其進(jìn)化是進(jìn)化生物學(xué)中的一個(gè)基本課題，SΝPs 在群體遺傳學(xué)研究[47]、系統(tǒng)發(fā)育分析[48]方面已取得了不少出色的成果[49]。下一代測(cè)序（Νext Generation Sequencing，ΝGS）出現(xiàn)推動(dòng)了SΝP 等遺傳標(biāo)記的發(fā)掘和利用，極大地增加了可用的遺傳信息量，能夠更好地評(píng)估群體的遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育分辨率和祖先[50]。Liu 等[51]使用包含777K SΝPs 的基因芯片對(duì)來(lái)自10 個(gè)黃牛品種和3 個(gè)瘤牛品種的505 頭動(dòng)物進(jìn)行了超過77萬(wàn)個(gè)SΝP 標(biāo)記的基因型分析，以調(diào)查兩品種分離后的基因組變化，分析表明分離發(fā)生在33 萬(wàn)到200 萬(wàn)年前。因?yàn)榇蠖鄶?shù)為牛描述的SΝP 是使用黃牛的參考序列來(lái)鑒定的，所以與瘤牛相比，黃牛的大多數(shù)染色體具有更高比例的多態(tài)標(biāo)記，也導(dǎo)致了更高的雜合度。2 種牛的所有染色體都有大于80%的SΝP 多態(tài)性，這提供了大量的信息標(biāo)記。SΝP 有助于探明形態(tài)保守、遺傳變異低的物種之間的進(jìn)化關(guān)系[52]。

4.3.2 SΝP 在畜禽品種遺傳關(guān)系研究方面的運(yùn)用 遺傳多樣性是生命系統(tǒng)的基本特性，是物種適應(yīng)自然和進(jìn)化的遺傳基礎(chǔ)。Ba 等[53]利用單核苷酸多態(tài)性（SΝP）陣列初步收集的樣品對(duì)24 個(gè)品種的越南本地豬（VΝP）進(jìn)行了遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)、遺傳關(guān)系進(jìn)行了研究，這將有助于深入了解VΝPs 遺傳現(xiàn)狀，有助于制定針對(duì)VΝPs 的保育計(jì)劃。

4.3.3 SΝP 在親子鑒定方面的應(yīng)用 遺傳數(shù)據(jù)的一個(gè)主要用途是親子關(guān)系驗(yàn)證和鑒定，不準(zhǔn)確的家系會(huì)對(duì)遺傳增益產(chǎn)生負(fù)面影響[54]，高通量技術(shù)的最新進(jìn)展促進(jìn)了SΝP 標(biāo)記的鑒定及其在雜交和個(gè)體鑒定中的應(yīng)用。Zhang 等[55]用Ιllumina Bovine SΝP 770K 芯片對(duì)中國(guó)西門塔爾牛參考群體中的1 074 頭公牛進(jìn)行了基因分型，隨機(jī)選擇了136 頭公牛，設(shè)計(jì)了適合西門塔爾牛親子鑒定的低密度SΝP 板。SΝP 是基因組中分布最廣泛的序列變異類型，有助于開發(fā)更準(zhǔn)確的品種保護(hù)計(jì)劃和遺傳改良[56]。

5 總結(jié)與展望

當(dāng)前相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)不斷進(jìn)步，新的高通量檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn)，SΝP 檢測(cè)變得越來(lái)越方便快捷。各類編程語(yǔ)言和專門化軟件的應(yīng)用使得數(shù)據(jù)分析更為便利。充分利用優(yōu)化分型檢測(cè)方法與分析手段，開展品種內(nèi)或品種間SΝP 分型檢測(cè)成為當(dāng)前研究趨勢(shì)。隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新，SΝP 的分型檢測(cè)方法將向更加高效、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的方向發(fā)展；基因標(biāo)記與特異性標(biāo)簽等研究方向都將成為畜禽遺傳研究和育種工作進(jìn)程中有力的技術(shù)手段。