徐向東 吳文君 蔡為民 李文靜 程振揚(yáng) 劉丹丹 許金俊 李金貴 陶建平

摘要 采用雞體試驗(yàn)法，利用相對(duì)卵囊產(chǎn)量（ROP）、病變記分減少率（RLS）、最適抗球蟲百分?jǐn)?shù)（POAA）和抗球蟲指數(shù)（ACI）4項(xiàng)指標(biāo)，測定了2株分離自如東縣養(yǎng)殖場的柔嫩艾美耳球蟲對(duì)地克珠利和鹽霉素的耐藥性。結(jié)果顯示，2株分離株對(duì)地克珠利無耐藥性或輕度耐藥，對(duì)鹽霉素均完全耐藥。建議如東縣養(yǎng)雞場停用鹽霉素，將地克珠利列入抗雞球蟲病藥物方案中。

關(guān)鍵詞 柔嫩艾美耳球蟲;田間分離株;耐藥性;檢測

中圖分類號(hào) S-855.9? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）12-0080-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.021

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Drug Resistance Detection of Field Isolates of Eimeria tenella to Diclazuril and Salinomycin

XU Xiang dong1，WU Wen jun1，2，CAI Wei min1 et al （1.Jiangsu Co innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses/College of Veterinary Medicine，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009; 2.Chahe Animal Husbandry and Veterinary Station of Rudong County，Nantong，Jiangsu 226432）

Abstract Selecting four indices of the relative oocyst production （ROP），the reduction of lesion scores（RLS），the? percent of optimum anticoccidial activity （POAA） and anticoccidial index （ACI），the body testing method was used to detect the resistance of two field isolates of Eimeria tenella collected from a farm in Rudong County to diclazuril and salinomycin.The results revealed that the two isolates showed no or mild resistance to diclazuril，and resistance to salinomycin.It was suggested that salinomycin should be withdrawan，and diclazuril could be used in the anti coccidiosis drug plan in the farm of Rudong County.

Key words Eimeria tenella;Field isolate;Drug resistance;Detection

雞球蟲病是由一種或多種艾美耳球蟲寄生于雞消化道引起的一種寄生蟲病，死亡率20%～30%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)80%，病愈的雛雞生長受阻，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。長期以來，雞球蟲病主要采用化學(xué)藥物進(jìn)行防治，并獲得了很好的經(jīng)濟(jì)效益，但藥物的長期使用不可避免地導(dǎo)致耐藥蟲株的產(chǎn)生。迄今為止，雞球蟲幾乎對(duì)所有藥物均出現(xiàn)不同程度的耐藥性，且對(duì)同類或作用機(jī)理相同的藥物產(chǎn)生一定程度的交叉耐藥性[4-7]。球蟲的耐藥性使藥物的防治效果降低甚至失效，有時(shí)即使增加藥物濃度，防治效果仍然不佳，導(dǎo)致臨床或亞臨床球蟲病的發(fā)生。增加用藥劑量或延長用藥時(shí)間可造成藥物殘留肉蛋，影響食品安全。江蘇省如東縣是農(nóng)業(yè)與養(yǎng)殖業(yè)大縣，據(jù)統(tǒng)計(jì)2018年全年家禽出欄2 430.72萬羽，其中草三黃、青腳雞、狼山雞等本土品種雞的飼養(yǎng)量占約50%，家禽規(guī)模養(yǎng)殖占99.28%以上，但飼養(yǎng)管理水平總體不高，再加上如東縣屬于北亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候區(qū)，氣候溫和、雨水充沛、空氣相對(duì)濕度大，這有利于雞球蟲病的流行，故雞球蟲病時(shí)有發(fā)生，給養(yǎng)雞業(yè)帶來很大的危害。為了解如東縣養(yǎng)雞場雞球蟲耐藥性的發(fā)生情況，筆者對(duì)分離自2個(gè)雞場的柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）進(jìn)行了耐藥性檢測，旨為指導(dǎo)生產(chǎn)中合理用藥和正確選擇抗球蟲藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 黃羽肉雞購自江蘇京海禽業(yè)集團(tuán)有限公司，出殼后即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)在嚴(yán)格消毒的鐵絲籠中，飼喂不含抗球蟲藥物的全價(jià)飼料。試驗(yàn)前用飽和鹽水漂浮法檢查，確認(rèn)無球蟲感染后用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)蟲株 2株柔嫰艾美耳球蟲田間分離株，分離自江蘇如東縣2個(gè)養(yǎng)雞場。球蟲分離與種類鑒定過程如下：按照常規(guī)方法從雞場分離卵囊，卵囊經(jīng)孢子化培養(yǎng)后感染雛雞，第8天從感染雞盲腸黏膜中分離卵囊，并培養(yǎng)至孢子化卵囊;孢子化卵囊再經(jīng)單卵囊接種雛雞[8]，獲得柔嫰艾美耳球蟲純種株。試驗(yàn)前按照常規(guī)方法擴(kuò)增卵囊，孢子化后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)藥物與給藥途徑 12.96%鹽霉素鈉預(yù)混劑，購自內(nèi)蒙古拜克生物有限公司，批號(hào)為201705018，按65×10-6的劑量混飼7 d。地克珠利溶液，購自濟(jì)魯動(dòng)物保健品有限公司，批號(hào)為1704003，按1×10-6的劑量飲水7 d。

1.4 試驗(yàn)分組 25日齡黃羽肉雞逐只稱重、編號(hào)，選擇體重相近的雛雞110羽，分成11個(gè)組，每組10只雞。每個(gè)蟲株設(shè)置5個(gè)組，即4個(gè)藥物試驗(yàn)組（每種藥物有1組重復(fù)）、1個(gè)感染不給藥組（陽性對(duì)照組）、 1個(gè)不感染不給藥組（2個(gè)蟲株的共同陰性對(duì)照組）。除了陰性對(duì)照組外，其余各試驗(yàn)組每只雞經(jīng)嗉囊接種8×104個(gè)孢子化卵囊。

1.5 臨床觀察與卵囊計(jì)數(shù) 感染后每天觀察雞的精神狀態(tài)、飲食、飲水和糞便情況，記錄血便排出情況，并參照Morehouse等[9]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行血便記分。在試驗(yàn)過程中死亡的雞，要及時(shí)剖檢，以確定是否死于雞球蟲病。感染后第8天，將全部試驗(yàn)雞稱重并剖殺，取盲腸觀察腸道病變，參照J(rèn)ohnson等[10]的方法進(jìn)行腸道病變記分。從第5天起，每天收集各組雞排出的全部糞便，采用麥克馬斯特氏法計(jì)數(shù)卵囊。第8天取盲腸內(nèi)容物與腸黏膜，用胃蛋白酶消化后收集卵囊，用麥克馬斯特氏法計(jì)數(shù)卵囊。將盲腸中卵囊數(shù)與該試驗(yàn)組第5～8天糞中卵囊數(shù)相加，即得到卵囊總產(chǎn)量，然后求出每組每只雞平均卵囊數(shù)。

1.6 耐藥性判定方法與標(biāo)準(zhǔn) 參照黃兵等[11]的方法，以最適抗球蟲百分?jǐn)?shù)（percent of optimum anticoccidial activity，POAA）、相對(duì)卵囊產(chǎn)量（relative oocyst production，ROP）、病變記分減少率（reduction of lesion scores，RLS）和抗球蟲指數(shù)（anticoccidial index，ACI）4項(xiàng)指標(biāo)綜合判定不同蟲株對(duì)藥物的耐藥程度。POAA>50 %為陰性，POAA≤50%為陽性;ROP≥15%為陽性，ROP<15%為陰性;RLS≥50%為陰性，RLS<50%為陽性;ACI≥160為陰性，ACI<160為陽性。4項(xiàng)指標(biāo)全部為陰性則判定為無耐藥性，1項(xiàng)指標(biāo)為陽性則判定為輕度耐藥，2項(xiàng)指標(biāo)為陽性則判定為中度耐藥，3～4項(xiàng)指標(biāo)為陽性則判定為完全耐藥。各項(xiàng)指標(biāo)計(jì)算公式如下：

POAA=（感染給藥組GSR-感染不給藥組GSR）÷（不感染不給藥組GSR-感染不給藥組GSR）×100%（1）

GSR=籠末重÷籠初重（2）

ROP=感染給藥組平均卵囊產(chǎn)量÷感染不給藥組×100%（3）

RLS=（感染不給藥組平均病變記分-感染給藥組平均病變記分）÷感染不給藥組平均病變記分×100%（4）

ACI=（存活率+相對(duì)增重率）-（病變值+卵囊值）[12]（5）

式中，存活率=（存活雞數(shù)÷開始雞數(shù)）×100%;相對(duì)增重率=（用藥組或感染不給藥組雞的平均增重÷不感染不給藥組雞的平均增重）×100%。病變值=每組的平均盲腸病變記分×10。卵囊值按角田清[13]的方法計(jì)算，即當(dāng)ROP為0～1%時(shí)，卵囊值為0;當(dāng)ROP為1%～25%時(shí)，卵囊值為5;當(dāng)ROP為26%～50%時(shí)，卵囊值為10;當(dāng)ROP為51%～75%時(shí)，卵囊值為20;當(dāng)ROP為76%～100%時(shí)，卵囊值為40。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 使用SPSS 23.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，并用鄧肯氏新復(fù)極差法對(duì)組間平均值進(jìn)行多重比較 （P<0.05） 。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床觀察與成活率

地克珠利給藥組排出血便數(shù)最少，血便記分為0（分離株1）、0.3和1.0分（分離株2），雞未發(fā)生死亡。鹽霉素給藥組排血便數(shù)較多，血便記分為3.3、3.6分（分離株1）、4.0分（分離株2），分離株1有1組死亡雞1只，分離株2分別死亡1只和2只。感染不給藥組排血便數(shù)最多，血便記分均為4.0分，分離株2死亡3只雞。在整個(gè)試驗(yàn)期間，不感染不給藥組雞均正常，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)糞檢未見卵囊。

2.2 平均增重與最適抗球蟲百分?jǐn)?shù) 各組的平均增重與最適抗球蟲百分?jǐn)?shù)見表1。由表1可知，各地克珠利組的平均增重與不感染不給藥對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05），各鹽霉素組的平均增重與不感染不給藥對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），與感染不給藥組相比差異不顯著（P>0.05）。各地克珠利組的最適抗球蟲百分?jǐn)?shù)均大于50%，各鹽霉素組的最適抗球蟲百分?jǐn)?shù)均小于50%。

2.3 病變記分減少率與相對(duì)卵囊產(chǎn)量

各組平均病變記分與病變記分減少率見表2。由表2可知，各地克珠利組的平均病變記分顯著低于感染不給藥對(duì)照組（P<0.05），各鹽霉素組的平均病變記分與感染不給藥對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）。各地克珠利組的病變記分減少率均大于50%，各鹽霉素組的病變記分減少率均小于50%。各鹽霉素組相對(duì)卵囊產(chǎn)量均在60%以上，均達(dá)耐藥指標(biāo)。各地克珠利組的相對(duì)卵囊產(chǎn)量，除了蟲株2有一個(gè)組為17.5%，其余均小于15%，均為藥物敏感。

2.4 抗球蟲指數(shù)

各試驗(yàn)組的抗球蟲指數(shù)見表3。由表3可知，分離株1地克珠利組抗球蟲指數(shù)均大于180，屬于抗球蟲高效水平;分離株2的地克珠利組抗球蟲指數(shù)均大于170，屬于抗球蟲中效水平。分離株1的鹽霉素組抗球蟲指數(shù)均大于120，但小于160，屬于抗球蟲低效水平;分離株2的鹽霉素組抗球蟲指數(shù)均小于120，屬于抗球蟲無效水平。

2.5 耐藥性判定結(jié)果

2株柔嫩艾美耳球蟲田間分離株對(duì)地克珠利和鹽霉素的耐藥性見表4。從POP、RLS、POAA、ACI這4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，2株分離株對(duì)鹽霉素均完全耐藥，而分離株1對(duì)地克珠利無耐藥性，分離株2對(duì)地克珠利無耐藥性或輕度耐藥。

3 討論

目前報(bào)道的雞球蟲耐藥性檢測方法有雞體實(shí)驗(yàn)法、細(xì)胞和雞胚培養(yǎng)法、超微結(jié)構(gòu)比較法、同工酶分析測定法、聚丙烯酰胺電泳技術(shù)、RAPD測定法和PCR 技術(shù)等[14]。在現(xiàn)場或雞場檢測雞球蟲的耐藥性一般用雞體實(shí)驗(yàn)法，即將試驗(yàn)藥物按規(guī)定劑量混飼或飲水飼喂一定日齡的雛雞，當(dāng)天或一定時(shí)間后接種從現(xiàn)場分離的球蟲，最后通過某些指標(biāo)，比如糞便記分、飼料轉(zhuǎn)化率、死亡率、卵囊產(chǎn)量或相對(duì)卵囊產(chǎn)量（ROP）、病變記分或病變記分減少率（RLS）、增重或最適抗球蟲活性百分率（POAA）、抗球蟲指數(shù)（ACI）等判定球蟲的耐藥性，或者以POAA、ROP、RLS 3個(gè)指標(biāo)或POAA、ROP、RLS、ACI 4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)定[6，11，15-16]。陳兆國等[16]對(duì)POAA、ROP、RLS和ACI 4項(xiàng)球蟲抗藥性判定指標(biāo)的準(zhǔn)確性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)ACI準(zhǔn)確性最好，ROP和RLS準(zhǔn)確性較低，POAA準(zhǔn)確性又高于RLS和ROP，認(rèn)為采用4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合判斷比較科學(xué)。該研究采用POAA、ROP、RLS和ACI 4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合判斷。

自從20世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)磺胺能治療雞球蟲病以來，藥物防治成為雞球蟲病的主要防控措施[17]。目前在臨床上使用的抗球蟲藥有數(shù)十種，主要包括化學(xué)合成類和離子載體抗生素類[18]。地克珠利是在1986年由比利楊森制藥廠研制的一種化學(xué)合成類抗球蟲藥，對(duì)柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、堆型等艾美球蟲均有效。地克珠利對(duì)球蟲的作用峰期隨球蟲的不同而異，對(duì)柔嫩艾美耳球蟲的無性生殖和有性生殖期都有作用，能抑制第一代和第二代裂殖生殖，抑制大、小配子間的受精作用，還能抑制卵囊壁的形成。地克珠利在我國于20世紀(jì)末就已成功合成，并在全國推廣使用[19]。地克珠利的耐藥性在1994年就出現(xiàn)了相關(guān)報(bào)道[20]。鹽霉素是在1968年由日本研究制藥株式會(huì)社東京研究所從白色鏈球菌的培養(yǎng)物中提取的產(chǎn)物，是第三個(gè)上市的離子載體類抗球蟲藥，對(duì)尚未進(jìn)入腸上皮細(xì)胞的球蟲子孢子有高度殺滅作用，對(duì)裂殖體有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)柔嫩艾美耳球蟲等多種球蟲有效。鹽霉素的作用機(jī)制是促使離子和水過多進(jìn)入球蟲蟲體而使其膨脹破裂。由于鹽霉素能提高飼料利用率和促進(jìn)雛雞生長發(fā)育作用，故在國內(nèi)外廣泛使用[1]。鹽霉素耐藥性蟲株1984年就出現(xiàn)在捷克[21]。

地克珠利與鹽霉素的耐藥性在我國最早報(bào)道于1994年和1996年[22-23]，現(xiàn)已在多個(gè)地區(qū)報(bào)道[4-5]。黃儀娟等[24]檢測了四川部分地區(qū)的6株雞球蟲對(duì)11種抗球蟲藥的耐藥性，結(jié)果顯示有2株球蟲對(duì)地克珠利完全耐藥;劉穎等[25]對(duì)柳州市分離于雞場的雞球蟲進(jìn)行耐藥性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)地克珠利完全耐藥，對(duì)鹽霉素輕度耐藥;李星星等[26]比較了地克珠利、鹽霉素、莫能菌素、尼卡巴嗪和海南霉素鈉對(duì)柔嫩艾美耳球蟲田間分離株的療效，結(jié)果顯示地克珠利和鹽霉素的ACI分別為159.8和159.6，均小于160。筆者測定了地克珠利和鹽霉素對(duì)如東縣柔嫩艾美耳球蟲田間分離株的耐藥性，結(jié)果顯示2株田間分離株對(duì)地克珠利無耐藥性或輕度耐藥，而對(duì)鹽霉素有完全耐藥。究其原因，可能是鹽霉素在該縣曾經(jīng)或現(xiàn)在已有廣泛使用，而地克珠利在該市使用較少或停用時(shí)間較長。鑒于這一檢測結(jié)果，建議該地區(qū)停用鹽霉素，使用地克珠利，同時(shí)必須定期進(jìn)行抗藥性的監(jiān)測。在使用抗球蟲藥物時(shí)應(yīng)進(jìn)行輪換用藥或聯(lián)合用藥，以延長藥物的使用壽命，同時(shí)還必須做好飼養(yǎng)管理等綜合性防治措施。

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