陳志堅

(福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 福州 350000；福建省特色旱作物品種選育工程技術(shù)研究中心， 福州 350013)

玉米進(jìn)入中國后，在西南地區(qū)種植的普通飼料玉米發(fā)生自然突變后經(jīng)人工選擇而獲得糯質(zhì)類型玉米，即糯玉米。學(xué)名ZeamaysL. sinensis Kulesh 即有“中國種”之意，糯玉米可作雜糧食用，具有一定的營養(yǎng)價值，可降低血液膽固醇濃度并防止其沉積于血管壁，能有效改善日常膳食結(jié)構(gòu)等，市場對品質(zhì)優(yōu)、營養(yǎng)價值高的糯玉米新品種要求越來越高[1]。但是目前糯育種玉米總產(chǎn)和品質(zhì)徘徊不前，根本原因是種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)狹窄和種質(zhì)資源匱乏，迫切需要拓寬和創(chuàng)造新的種質(zhì)資源[2]。因此，為了適應(yīng)市場的需求，選育更多優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)糯玉米新品種，就需要利用現(xiàn)代生物技術(shù)對糯玉米種質(zhì)資源進(jìn)行深入的研究，從分子水平了解他們的親緣關(guān)系，為新品種選育提供參考。玉米是雜種優(yōu)勢研究的代表性作物，新品種的選育最重要的是選擇的玉米自交系配合力高，組配后有雜種優(yōu)勢，如果對現(xiàn)有的玉米自交系的親緣和血緣關(guān)系在分子水平上有科學(xué)的認(rèn)識，那將極大提高玉米自交系的改良及新品種的選育效率，但是自“雜種優(yōu)勢”概念的提出并運(yùn)用于玉米育種實(shí)踐后，隨著玉米雜交種的推廣，玉米種質(zhì)資源的匱乏且遺傳基礎(chǔ)狹窄已經(jīng)成為玉米育種界的共識[3-6]。研究表明，RAPD，RFLP，SSR、SNP等分子標(biāo)記技術(shù)提供的遺傳多態(tài)性信息含量豐富，結(jié)合相應(yīng)遺傳分析軟件，可以從分子水平上科學(xué)準(zhǔn)確的掌握自交系間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，玉米具有良好的雜種優(yōu)勢，利用這個優(yōu)勢進(jìn)行育種是選育玉米新品種的重要手段，詳細(xì)了解親本之間的親緣關(guān)系和雜種優(yōu)勢，從而更好地利用已有的各種優(yōu)異種質(zhì)資源，選育出更高產(chǎn)、更優(yōu)質(zhì)的新品種[7-10]。前人通過SSR和SNP標(biāo)記技術(shù)對玉米遺傳多樣性進(jìn)行過研究，SSR和SNP分子標(biāo)記方法的劃群結(jié)果均與系譜來源基本一致，且適用于糯玉米自交系的遺傳多樣性分析，同時結(jié)合自交系的田間表型性狀劃，一般配合力和特殊配合力的數(shù)據(jù)，可以很大程度上提高育種效率[11-13]。本研究通過分子標(biāo)記技術(shù)，從收集的糯玉米種質(zhì)資源中選出87份農(nóng)藝性狀較好的骨干自交系，利用國家玉米DUS測試使用的40個SSR 核心標(biāo)記進(jìn)行遺傳聚類分析。從分子水平對87份糯玉米種質(zhì)資源的親緣關(guān)系進(jìn)行聚類分析，為構(gòu)建育種群體提供親緣關(guān)系參考，從而提高糯玉米雜種優(yōu)勢利用質(zhì)量，加快優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)糯玉米和甜加糯玉米新品種選育效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為課題組近年收集的87份糯玉米自交系，含4個雙隱自交系N 1、N 3、N 4、N 5，12個紫色糯玉米自交系N 3、N 4、N 15、N 17、N 24、N 31、N 42、N 47、N 48、N 57、N 79、N 81，3個黃糯自交系N 72、N 73、N 75，其余67份為普通白色糯玉米自交系(表1)。

表1 87份糯玉米自交系代號

利用玉米品種鑒定規(guī)程SSR標(biāo)記法(NY/T 1432—2014)所用的40對SSR核心引物為標(biāo)記[13](表2)。

1.2 試驗(yàn)方法

以87份自交系2葉1心新鮮葉片為材料，用葉片DNA提取法 CTAB方法提取葉片基因組DNA。PCR擴(kuò)增總體積為10 μL，其中包括混合酶5 μL，上下游引物0.8 μL，DNA 2 μL，ddH2O 2.2 μL(混合酶和引物均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。采用基因公司MG 96 G型 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程為:94 ℃模板DNA預(yù)變性5 min后，94 ℃變性55 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸55 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在40%聚丙烯酰胺凝膠120 V電壓下電泳90 min，銀染顯影。

根據(jù) PCR 擴(kuò)增圖譜，在相同位置有條帶標(biāo)記1，沒有條帶標(biāo)記0，缺失標(biāo)記9，建立矩陣數(shù)據(jù)庫。計算多態(tài)性含量 (PIC)，各自交系間的遺傳相似系數(shù)(GS)和遺傳距離(GD)，分別由SPAGeDi、PowerMarker V 3.25 和 MEGA 5.1軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR多態(tài)性分析

用40對SSR標(biāo)記對87份糯玉米自交系進(jìn)行多態(tài)性試驗(yàn)。利用PowerMarker V 3.25軟件分析，結(jié)果表明，40對核心引物SSR標(biāo)記共檢測到等位基因變異數(shù)89個，檢測的每對引物等位基因變異平均為2.23個，變異的范圍是1～4個，多態(tài)性信息含量PIC平均為0.32，等位基因頻率平均為0.71。40個SSR標(biāo)記的87份糯玉米自交系上PIC值平均為0.32，根據(jù)0.25

2.2 87份自交系基因型間的親緣關(guān)系(Kinship)分析

利用SPAGeDi軟件獲得群體的親緣關(guān)系矩陣，同時將矩陣中的負(fù)值設(shè)置為0，根據(jù)親緣關(guān)系矩陣進(jìn)行評估群體親緣關(guān)系的分布。分析87份自交系的Kinship得出，99.2%的自交系Kinship系數(shù)在0～0.5之間，其中59.8%的自交系Kinship系數(shù)為0，說明59.8%的自交系間無親緣關(guān)系；10.5%的自交系Kinship系數(shù)為0～0.1之間，說明這些自交系之間的親緣關(guān)系較弱；29.7%的自交系Kinship系數(shù)為0.1～0.5之間，表明這些自交系親緣關(guān)系較近；0.8%的自交系Kinship系數(shù)分布為0.5～1.2之間，說明這些自交系間的親緣很近，無雜種優(yōu)勢。其中，ZN 18與YYH 06之間的Kinship系數(shù)最大，為1.17，C 6 F與Z 362之間Kinship系數(shù)次之，為1.16，說明這兩對自交系的親緣關(guān)系很近，無雜種優(yōu)勢，不適合組配雜交種。

圖2 87份自交系的Kinship系數(shù)分布Fig.2 Kinship coefficient distribution of 87 inbred lines

2.3 87份自交系基因型的遺傳聚類分析

利用PowerMarker V 3.25 軟件分析87份糯玉米的基因分型數(shù)據(jù)，利用MEGA 5.1軟件，計算87份糯玉米自交系之間的遺傳距離，通過構(gòu)建遺傳圖譜進(jìn)行遺傳聚類分析，87份糯玉米自交系間的遺傳距離在0～0.63之間，平均為0.23；其中，自交系ZN 18與YYH 06之間遺傳距離最小，與Kinship分析結(jié)果一致。將87個糯玉米自交系分為四個類群，以N 8為代表的69個自交系為Ⅰ群，N 37為代表的10個自交系為Ⅱ群，N 15為代表的5個自交系為Ⅲ群，N 65為代表的3個自交系為Ⅳ群。聚類將4個雙隱的自交系N 1、N 3、N 4、N 5聚合在一起，同時，N 5與N 3和N 4的Kinship值為1.16和1.099 4，也表明他們之間有較近的親緣關(guān)系。12個紫色糯玉米自交系在Ⅰ群，3個黃糯自交系N 72，N 73，N 75在Ⅰ群，他們的Kinship值接近0.5，互相組配雜種優(yōu)勢不強(qiáng)。

根據(jù)遺傳分析劃分四個群，根據(jù)自交系生長特點(diǎn)，結(jié)合Kinship值可明確自交系的利用方向，提高組配成功率。比如，N 1田間表現(xiàn)植株較矮，籽粒白，棒細(xì)長，配合力好，與N 1的Kinship值為0的自交系有47個，理論上可以從中組配出皮薄、脆、口感好的甜加糯新品種；黃色籽粒糯玉米自交系N 72，植株粗壯，果穗籽粒排列整齊色澤光亮，可以選擇Kinship值為0或者較低的白色自交系進(jìn)行組配，篩選黃白色澤對比度好品質(zhì)優(yōu)的雙色甜加糯新品種。通過聚類和Kinship分析，將糯玉米自交系劃分至不同的群中，明確自交系間的遺傳距離和親緣關(guān)系，提高育種效率。

表3 40對引物遺傳分析信息

圖3 87份糯玉米自交系遺傳距離NJ聚類分析 Fig.3 Neighbor-joining cluster map of genetic distance of 87 waxy maize inbred lines

3 討 論

采用分子標(biāo)記技術(shù)研究玉米遺傳信息，對改良玉米自交系和組配優(yōu)質(zhì)雜交組合有很高的參考價值。本研究采用40對SSR引物，在87份玉米自交系中檢測到89個等位基因變異，平均每對引物檢測出的等位基因變異為2.23個，變異范圍為1～4。通過聚類分析與Kinship系數(shù)分析，利用SSR分子標(biāo)記可以有效得出玉米自交系間的親緣關(guān)系，可以將親緣關(guān)系不清或血緣關(guān)系不明晰的玉米種質(zhì)資源進(jìn)行科學(xué)的劃分，為科學(xué)劃分玉米雜種優(yōu)勢群和雜交種的組配提供科學(xué)參考。

Kinship系數(shù)能清晰地反映87份自交系之間兩兩的遺傳親緣關(guān)系。N 4、N 5兩個均為雙隱改良親本選的二環(huán)系的姊妹系，與Kinship值為1.10相吻合，兩者組配無雜種優(yōu)勢，與實(shí)際組配情況一致。利用Ⅰ群中的N 13與Ⅲ群的N 2和N 15雜交，組配出兩個雜種優(yōu)勢優(yōu)良的組合閩糯133(閩審玉20180007)和花糯1101(贛審玉20170004)。N 13與N 2、N 15的Kinship相似系數(shù)分別為0和0.12，從分子水平也說明他們具有一定雜種優(yōu)勢。以此為指導(dǎo)，用N 13與Ⅲ群中的N 33、N 77、N 84組配，檢驗(yàn)后代雜種優(yōu)勢是否與遺傳分析結(jié)果相一致。

目前，選育的在參試或者已經(jīng)通過的幾個新品種，花糯1101由N 13與N 15組配而來，2017年通過江西省審定；閩糯133由N 13與N 2組配而來，2018年通過福建省審定；閩糯811由N 13與N 58組配而來，2018年通過福建省審定，審定編號為閩審玉20180006；這3個組合間的Kinship值均為0。

在甜加糯品種選育方面，N 3作為雙隱親本，植株中等，花粉量大，與其Kinship值為0的自交系達(dá)49個，目前組配的4個甜加糯玉米新組合閩花甜糯136，薈甜糯139，閩甜糯251和閩甜糯816正在參加南方國家糯玉米區(qū)試、國家東南科企聯(lián)合體糯玉米區(qū)試和福建省糯玉米區(qū)試，其中閩花甜糯136以產(chǎn)量第一的優(yōu)勢通過國家東南區(qū)2018年糯玉米區(qū)試 ，進(jìn)入2019年續(xù)試。說明N 3配合力高，可以繼續(xù)與其他更多的Kinship值為0 的自交系進(jìn)行組配，篩選出優(yōu)質(zhì)甜加糯新品種。

王兵偉等[14]和韓晴等[15]采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對玉米自交系進(jìn)行聚類，分析結(jié)果與已知系譜關(guān)系基本一致，說明SSR分子標(biāo)記技術(shù)可靠，可用于玉米自交系遺傳多樣性分析。福建省糯玉米種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)比較狹窄，育種中突破較少，隨著近些年的對外交流，在種質(zhì)資源創(chuàng)制方面取得一些突破，今后在加強(qiáng)對現(xiàn)有的種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析研究和利用的基礎(chǔ)上，加大種質(zhì)資源的創(chuàng)制、引進(jìn)與改良工作，結(jié)合現(xiàn)代分子育種技術(shù)，通過掌握他們之間的親緣關(guān)系，進(jìn)行有目的性的創(chuàng)制，能夠提高親緣關(guān)系較近的自交系間的多態(tài)性位點(diǎn)和SSR位點(diǎn)的等位基因數(shù)，促進(jìn)該類群自交系的利用，結(jié)合種質(zhì)資源自身特性配合力高低等，為后續(xù)骨干自交系的選育和優(yōu)質(zhì)組合的組配提供科學(xué)的指導(dǎo)[16-18]。