劉世光，田伶伶，史冬梅，王 聰，劉 聰

(1.遼陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，遼寧 遼陽 111000；2.遼寧省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，遼寧 沈陽 110000；3.鐵嶺市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，遼寧 鐵嶺 112000)

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第5位[1]。胃癌根據(jù)癌灶部位分為胃底賁門癌、胃體癌、胃竇癌等[2]。當(dāng)前胃癌的治療方案主要包括手術(shù)和化學(xué)治療，但術(shù)后輔助化學(xué)治療長期治療效果并不理想，據(jù)報(bào)道大約50%的胃癌手術(shù)患者腫瘤會(huì)復(fù)發(fā)[3]，且不良反應(yīng)多，耐藥率高，中位總生存期不盡如人意[4]。因此，傳統(tǒng)的胃癌治療方案不能滿足臨床需求，必須探索新的治療方法。

在胃癌的研究進(jìn)展中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多與胃癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白，但卻很少被實(shí)際應(yīng)用于臨床，因此，加強(qiáng)對功能基因應(yīng)用的研究將有益于胃癌治療策略的制定。叉頭框蛋白D3(Forkhead box D3，F(xiàn)oxD3)是FOX家族成員之一，具有保持胚胎干細(xì)胞多能性，調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、侵襲、血管形成和遷移的作用，且在多種腫瘤中異常表達(dá)[5-6]。已有研究表明FoxD3在胃癌組織中高表達(dá)，并可能通過Wnt/β-catenin信號促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展[7]。但FoxD3在胃癌中的具體作用機(jī)制仍不清楚。本文通過干擾FoxD3，探討其對胃癌細(xì)胞SGC-7901生長、運(yùn)動(dòng)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基(61870-127)、胎牛血清(10099-141)、胰蛋白酶(15050-057)和青—鏈霉素(15140-122)均購自美國賽默飛世爾科技公司；永生化胃黏膜上皮細(xì)胞系GES和人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(P0012S)購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Transwell(3374)購自美國Corning公司；兔抗FoxD3(ab64807)、Ki67(ab15580)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA，ab18197)、上皮鈣黏蛋白(E-cadherin，ab15148)、神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cadherin，ab18203)、波形蛋白(Vimentin，ab137321)、β-actin(ab8227)單克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將GES細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中用高糖RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青—鏈霉素)培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)基，收集細(xì)胞時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化，試驗(yàn)選用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞處理及分組

設(shè)計(jì)3條不同的shRNA序列干擾片段(FoxD3-shRNA1、FoxD3-shRNA2和FoxD3-shRNA3)轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞干擾FoxD3表達(dá)。通過Western blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)選擇最佳干擾序列shRNA2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞隨機(jī)分為Control組、shRNA-NC組和FoxD3-shRNA2組。Control組不作處理，shRNA-NC組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒，F(xiàn)oxD3-shRNA2組轉(zhuǎn)染shRNA2。

1.4 RT-PCR檢測相關(guān)mRNA表達(dá)

用TRIzol法從各組SGC-7901細(xì)胞中提取總RNA，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用FastKing RT試劑盒通過標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)進(jìn)行mRNA的逆轉(zhuǎn)錄，使用Fast qPCR Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s。FoxD3-shRNA1 F：5’-AGCAAGCCCAAGAATAGC-3’，R：5’-TC CAGGGTCCAGTAGTTG-3’；FoxD3-shRNA2 F：5’-AGC GCCAGCGATATGTCCG-3’，R：5’-TGCCAGGGCTTGC GGTTGA-3’；FoxD3-shRNA3 F：5’-ACTCTGCCTCTCC CCAATTT-3’，R：5’-CCATCCCCACGGTACTAAGA-3’；β-actin F：5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，R：5’-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。以β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCT方法進(jìn)行定量計(jì)算。

1.5 克隆形成法檢測細(xì)胞克隆形成率

將SGC-7901細(xì)胞接種至6孔板，每孔約500個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)7 d后棄掉上清液，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，洗凈干燥后于顯微鏡下觀察各組克隆形成數(shù)目，計(jì)算克隆形成率。細(xì)胞克隆形成率(%)=細(xì)胞克隆總數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 Transwell檢測侵襲細(xì)胞數(shù)

取無血清培養(yǎng)基稀釋的人工基底膜，加入Transwell上室，37 ℃風(fēng)干。取對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，上室中加入200 μL細(xì)胞懸液，下室中加500 μL含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h，棉簽擦去基質(zhì)膠和上室細(xì)胞，多聚甲醛固定后染色。光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)并拍照，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞劃痕愈合率

按1.3所述方法分組處理SGC-7901細(xì)胞后，將細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞長滿約80%時(shí)用中槍頭垂直于6孔板水平劃線，PBS緩沖液清洗3次后，加入無血清的培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取樣拍照。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.8 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化形態(tài)學(xué)觀察

取各組對數(shù)生長期細(xì)胞，通過顯微鏡觀察各組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化形態(tài)學(xué)變化。

1.9 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。4 ℃下加入FoxD3、Ki67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin一抗(1∶1 000)孵育過夜，TBST清洗后加入HRP-IgG(1∶10 000)，加入電化學(xué)發(fā)光顯色液顯色。以β-actin為內(nèi)參，Image J V1.8.0.112軟件分析各組細(xì)胞目的蛋白與β-actin比值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FoxD3 mRNA和蛋白表達(dá)水平

與GES細(xì)胞比較，SGC-7901細(xì)胞中FoxD3 mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1a；與Control組比較，F(xiàn)oxD3-shRNA1組、FoxD3-shRNA2組、FoxD3-shRNA3組細(xì)胞中FoxD3 mRNA水平均降低，F(xiàn)oxD3-shRNA2組mRNA水平最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1b。選擇最佳干擾序列shRNA2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與Control組比較，F(xiàn)oxD3-shRNA2組FoxD3蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1c。

a：RT-PCR檢測GES細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞中FoxD3 mRNA水平；b：RT-PCR檢測3個(gè)FoxD3 shRNA中FoxD3 mRNA水平；c：Western blot檢測FoxD3蛋白表達(dá)水平 *：與GES細(xì)胞比較，P<0.05；#：與Control組比較，P<0.05

2.2 shRNA-FoxD3抑制SGC-7901細(xì)胞增殖

與Control組比較，F(xiàn)oxD3-shRNA2組細(xì)胞克隆形成率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 shRNA-FoxD3下調(diào)SGC-7901細(xì)胞中Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平

與Control組比較，F(xiàn)oxD3-shRNA2組Ki67、PCNA蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.4 shRNA-FoxD3降低SGC-7901細(xì)胞侵襲能力

與Control組比較，F(xiàn)oxD3-shRNA2組侵襲細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

2.5 shRNA-FoxD3抑制SGC-7901細(xì)胞遷移

與Control組比較，F(xiàn)oxD3-shRNA2組細(xì)胞劃痕愈合率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

2.6 shRNA-FoxD3抑制SGC-7901細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

Control組及shRNA-NC組細(xì)胞呈分散的類圓或紡錘體樣，細(xì)胞之間黏附力降低，大量細(xì)胞由上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，F(xiàn)oxD3-shRNA2組細(xì)胞排列緊密，少數(shù)細(xì)胞呈間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，與Control組比較，F(xiàn)oxD3-shRNA2組上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化受到抑制，見圖6。

a：克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測各組SGC-7901細(xì)胞克隆情況(×200)；b：半定量分析各組SGC-7901細(xì)胞克隆形成率 *：與Control組比較，P<0.05

2.7 shRNA-FoxD3上調(diào)SGC-7901細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)，下調(diào)N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)

與Control組比較，F(xiàn)oxD3-shRNA2組E-cadherin蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

a：Western blot檢測各組SGC-7901細(xì)胞中Ki67、PCNA蛋白表達(dá)；b：半定量分析各組SGC-7901細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá) *：與Control組比較，P<0.05

a：Transwell檢測各組SGC-7901細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)(×200)；b：半定量分析各組SGC-7901細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù) *：與Control組比較，P<0.05

a：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組SGC-7901細(xì)胞遷移(×200)；b：半定量分析各組SGC-7901細(xì)胞劃痕愈合率 *：與Control組比較，P<0.05

圖6 shRNA-FoxD3對SGC-7901細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響(×200)

3 討論

胃癌是具有高度侵入性和攻擊性的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的生命和健康[8]。尋找胃癌早期診斷及治療的方案具有重要意義。已有研究表明，F(xiàn)oxD3可預(yù)測胃癌患者的預(yù)后[9]。FoxD3可能是繼CD44v6的另一種特異性胃癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、分化、增殖和凋亡中起重要作用[10]。

a：Western blot檢測各組SGC-7901細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)；b：半定量分析各組SGC-7901細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá) *：與Control組比較，P<0.05

胃癌細(xì)胞早期就易發(fā)生轉(zhuǎn)移，主要是由于胃癌細(xì)胞增殖能力極強(qiáng)[11]。抑制胃癌細(xì)胞增殖是控制胃癌進(jìn)展的關(guān)鍵。Ki67是一種增殖細(xì)胞核相關(guān)抗原，其水平高低可反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)，相關(guān)研究表明Ki67在胃癌組織中高表達(dá)[12]。PCNA是一種與細(xì)胞增殖狀態(tài)有關(guān)的核蛋白，隨著臨床分期增加和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，其表達(dá)水平逐漸增高，可反映癌細(xì)胞增殖情況及所處細(xì)胞周期[13]。本研究Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染shRNA-FoxD3載體后，SGC-7901細(xì)胞中Ki67、PCNA蛋白表達(dá)降低，提示敲低FoxD3表達(dá)可抑制SGC-7901細(xì)胞增殖。

胃癌細(xì)胞的高遷移率致使患者術(shù)后易發(fā)生局部侵襲甚至轉(zhuǎn)移，這也是造成胃癌患者死亡的直接原因[14]。劉四衛(wèi)等[5]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxD3過表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。朱婧等[15]研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性直腸癌組織中FoxD3蛋白表達(dá)低于正常組織，且與結(jié)腸癌腫瘤的發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。本研究通過Transwell和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染shRNA-FoxD3載體后，SGC-7901細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率均降低，提示敲低FoxD3表達(dá)可抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲和遷移。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是正常上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)表型細(xì)胞的過程，胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移及腫瘤干細(xì)胞特性與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程密切相關(guān)[16]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在胃癌組織和細(xì)胞中均表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)的降低和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin、Vimentin的過表達(dá)[17]。Benayoun等[18]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxD3可通過介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤干細(xì)胞的形成，維持腫瘤干細(xì)胞特性及腫瘤耐藥。本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染shRNA-FoxD3載體后，SGC-7901細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)，N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)，提示敲低FoxD3表達(dá)可抑制SGC-7901細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

綜上所述，shRNA-FoxD3具有抑制SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力。敲低FoxD3表達(dá)對防止胃癌的進(jìn)展具有重要意義。