李成成，苑楠楠，白樺芳，王 媛，魏 嵐，孫立新

基于HPLC指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的消炎退熱顆粒質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）預(yù)測(cè)

李成成，苑楠楠，白樺芳，王 媛，魏 嵐，孫立新*

沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 本溪 117004

基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析預(yù)測(cè)消炎退熱顆粒質(zhì)量標(biāo)志物（quality markers，Q-Marker）。采用HPLC法，以秦皮乙素為參照，建立20批消炎退熱顆粒的指紋圖譜。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012A版）對(duì)20批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰。通過(guò)與單味藥材溶液和混合對(duì)照品溶液色譜峰進(jìn)行對(duì)比，對(duì)共有峰進(jìn)行藥味歸屬，并指認(rèn)化學(xué)成分。采用聚類分析進(jìn)行分類評(píng)價(jià)，運(yùn)用有監(jiān)督模式偏最小二乘法-判別分析篩選出造成組間差異的主要標(biāo)志性成分。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選和分析消炎退熱顆粒相關(guān)的作用靶點(diǎn)和通路，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，預(yù)測(cè)消炎退熱顆粒的Q-Marker。成功建立21個(gè)共有峰的指紋圖譜，篩選出4個(gè)差異成分可作為消炎退熱顆粒差異標(biāo)志物，分別為秦皮乙素、新綠原酸、菊苣酸和咖啡酸，作為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究對(duì)象。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示篩選出4種差異成分均可作為潛在Q-Marker。建立的HPLC指紋圖譜分析方法準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好，較全面、直觀地反映了消炎退熱顆粒整體化學(xué)成分信息，篩選出4個(gè)可作為消炎退熱顆粒潛在Q-Marker的化學(xué)成分，為消炎退熱顆粒質(zhì)量的全面控制提供參考，同時(shí)也為消炎退熱顆粒藥效關(guān)聯(lián)物質(zhì)基礎(chǔ)的研究及作用機(jī)制的探索奠定基礎(chǔ)。

消炎退熱顆粒；HPLC；指紋圖譜；相似度分析；聚類分析；偏最小二乘法-判別分析；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；質(zhì)量標(biāo)志物；秦皮乙素；新綠原酸；菊苣酸；咖啡酸

消炎退熱顆粒（Xiaoyan Tuire Granules，XTG）由大青葉、蒲公英、紫花地丁、甘草4味中藥組成，具有清熱解毒、涼血消腫的功效[1]。此方大青葉、蒲公英為君藥，二藥性味苦寒，合用有清熱解毒、消腫散結(jié)、涼血消斑之效。紫花地丁為臣藥，味苦辛，性寒，助君藥清熱解毒、涼血消腫。甘草為佐使，以其甘平之性補(bǔ)脾益氣、扶正驅(qū)邪，助君臣清熱解毒，且能調(diào)和諸藥。四藥合用，發(fā)揮清瀉肝胃熱毒、疏散心肺火熱、涼血消腫功效。

中藥及其復(fù)方制劑系統(tǒng)龐大，成分復(fù)雜，市面上的產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊?；诖吮尘?，2016年劉昌孝院士[2]提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality markers，Q-Marker）概念，Q-Marker與中藥功能屬性密切相關(guān)，是可以定性定量的特有化學(xué)成分，可作為反映中藥安全性和有效性的標(biāo)示性物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制。中藥指紋圖譜是一種綜合的可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評(píng)價(jià)中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性，為中藥及中藥制劑質(zhì)量控制提供有效手段[3-11]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)可以快速發(fā)現(xiàn)中藥主要作用通路及作用靶點(diǎn)，對(duì)于預(yù)測(cè)中藥成分的潛在作用靶點(diǎn)具有重要意義[12-15]?；谥兴幒蛷?fù)方制劑具有多成分、多靶點(diǎn)及多通路的特點(diǎn)，兩者結(jié)合既能評(píng)估制劑質(zhì)量的優(yōu)劣，又能說(shuō)明藥效的強(qiáng)弱，更具說(shuō)服力[16-22]。

本研究通過(guò)建立XTG的HPLC指紋圖譜，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，初步篩選出差異標(biāo)志物。并以其為研究對(duì)象，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)尋找潛在作用靶點(diǎn)和作用通路，進(jìn)而預(yù)測(cè)Q-Marker。旨在為全面控制XTG的質(zhì)量提供依據(jù)，為XTG作用機(jī)制的研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-20A型HPLC儀，包括SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、LC-20AT型二元泵、Lab Solution工作站，日本島津公司；RPL-D2000型柱溫箱，大連日普利科技儀器有限公司；TG332A型微量分析天平，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；KQ5200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；PB-10標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)，德國(guó)Sartorius公司。

1.2 數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件

Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/search/）、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http:// www.swisstargetprediction.ch/）、Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org）、String網(wǎng)站（https:// string-db.org/）、Cytoscape軟件（版本號(hào)：3.7.1）、David 6.7數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）、微生信網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.com.cn/）。

1.3 藥品與試劑

XTG購(gòu)自2個(gè)廠家，各10批，批號(hào)190806、190807、190407、200224、200304、191012、191106、200310、200313、190904樣品購(gòu)自陜西步長(zhǎng)制藥有限公司（廠家A），規(guī)格10 g/袋，分別編號(hào)為SA1～SA10；批號(hào)ZFA1802、ZGA1801、ZGA1902、ZBA2001、ZEA2001、ZHA1901、ZBA2002、ZCA1901、ZEA2003、ZGA1901樣品購(gòu)自云南白藥集團(tuán)股份有限公司（廠家B），規(guī)格10 g/袋，分別編號(hào)為SB1～SB10；鳥苷對(duì)照品，批號(hào)1028B021，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；新綠原酸對(duì)照品，批號(hào)X-014-180410，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；對(duì)照品秦皮甲素（批號(hào)KA0422CA14）、秦皮乙素（批號(hào)C25J7Y18390）、咖啡酸（批號(hào)W16O10B021）、菊苣酸（批號(hào)Y24J11Y119342）、靛玉紅（批號(hào)J19A10T95563），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98.0%，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純，其他試劑均為分析純；水為純凈水，購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

大青葉和紫花地丁藥材，購(gòu)自九洲恒源（安國(guó)）藥業(yè)有限公司；甘草購(gòu)自亳州市永剛飲片廠有限公司；蒲公英購(gòu)自安國(guó)路路通中藥飲片有限公司，經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)功能食品與葡萄酒學(xué)院賈英教授鑒定，大青葉為十字花科菘藍(lán)屬植物菘藍(lán)Fort.的干燥葉，蒲公英為菊科蒲公英屬植物蒲公英Hand. -Mazz.的干燥全草，紫花地丁為堇菜科堇菜屬植物紫花地丁Makino的干燥全草，甘草為豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-25%甲醇乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～30 min，8%～10% B；30～44 min，10%～12% B；44～58 min，12%～13.5% B；58～95 min，13.5% B；95～125 min，13.5%～35% B；125～135 min，35%～65% B；135～150 min，65% B；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取各對(duì)照品適量，精密稱定，加75%甲醇配制成含鳥苷11.0 μg/mL、新綠原酸10.2 μg/mL、秦皮甲素10.1 μg/mL、秦皮乙素10.6 μg/mL、咖啡酸13.9 μg/mL、菊苣酸10.4 μg/mL、靛玉紅20.0 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品約1.5 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，超聲（250 W，40 kHz）30 min，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，得供試品溶液。

2.2.3 單味藥材溶液 按照XTG的制備工藝，將大青葉、蒲公英、紫花地丁和甘草分別加水煎煮2次，每次2 h，煎液濾過(guò)，濾液合并，濃縮至相對(duì)密度為1.25～1.30（80 ℃），加3倍量乙醇，攪拌，靜置24 h，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.20（80 ℃），加蔗糖粉及淀粉適量，干燥得單味藥材粉末。根據(jù)處方比例稱取，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，即得單味藥材溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 參照峰的選擇 《中國(guó)藥典》2020年版將秦皮乙素作為評(píng)價(jià)XTG質(zhì)量的指標(biāo)性成分，其含量較高，色譜峰較穩(wěn)定，故選擇秦皮乙素作為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)為S5），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，21個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不大于1.3%，相對(duì)峰面積的RSD均不大于3.0%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（編號(hào)為S5）1.5 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，21個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不大于1.7%，相對(duì)峰面積的RSD均不大于3.0%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)為S5），室溫下放置，分別于0、4、8、12、24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，21個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不大于2.0%，相對(duì)峰面積的RSD均不大于2.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與相關(guān)性評(píng)價(jià)

2.4.1 共有峰的指認(rèn) 取按“2.2”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液和混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，通過(guò)對(duì)比樣品色譜峰和對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間，鑒定7個(gè)化合物，分別為鳥苷、新綠原酸、秦皮甲素、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸、靛玉紅，見圖1。

2.4.2 聚類分析 以秦皮乙素為內(nèi)參照峰，計(jì)算20批XTG的HPLC指紋圖譜各色譜峰相對(duì)內(nèi)參照峰的面積之比，應(yīng)用SPSS 21.0軟件對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析，采用離差平方和法（Ward’s method），將歐式距離的平方（squared Euclidean distance）作為樣品的測(cè)量尺度，結(jié)果見圖2。由圖2可知，20批樣品可聚為2大類：SA1～SA10、SB1～SB3、SB6、SB10為第I類；SB4、SB5、SB7～SB9為第II類。第II類全部為廠家B產(chǎn)品；第I類為廠家A和部分廠家B產(chǎn)品，說(shuō)明不能以生產(chǎn)廠家為分類方式。

2.4.3 指紋圖譜的建立與對(duì)照指紋圖譜的生成 將質(zhì)量較均一的15批XTG導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年A版）”，得到15批XTG指紋圖譜，見圖3-A。以秦皮乙素為參照，標(biāo)定21個(gè)共有峰，生成對(duì)照指紋圖譜，見圖3-B。

2.4.4 相似度的計(jì)算 將20批樣品指紋圖譜與采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年A版）”生成的對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比較，計(jì)算相似度。結(jié)果顯示，第一類15批樣品SA1～SA10、SB1～SB3、SB6、SB10的相似度分別為0.998、0.996、0.998、0.986、0.995、0.979、0.996、0.989、0.984、0.995、0.967、0.985、0.986、0.993、0.998，得到各個(gè)指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.96；第2類5批樣品SB4、SB5、SB7～SB9的相似度分別為0.970、0.963、0.974、0.944、0.949，得到各個(gè)指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.94。由上面的數(shù)據(jù)可知，根據(jù)聚類分成的2類在相似度上存在差異。但總的來(lái)說(shuō)20批的相似度均大于0.94，表明XTG質(zhì)量均一穩(wěn)定。

2-鳥苷 7-新綠原酸 8-秦皮甲素 9-秦皮乙素 10-咖啡酸 17-菊苣酸 21-靛玉紅

圖2 XTG聚類分析樹狀圖

2.4.5 偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA） 為了更好地觀察不同廠家樣品間的組內(nèi)差異，本研究進(jìn)行有監(jiān)督的PLS-DA，獲得相應(yīng)模型，PLS-DA得分圖見圖4。從模型驗(yàn)證的參數(shù)圖可知，模型的穩(wěn)定性和交叉驗(yàn)證的預(yù)測(cè)力都較高（2＝0.843、2＝0.903），說(shuō)明所建立的PLS-DA模型可以很好地用于不同廠家制劑的分析。由圖4可知，2個(gè)生產(chǎn)廠家的20批樣品均分布在95%置信區(qū)間內(nèi)，且依據(jù)生產(chǎn)廠家不同分別分布在不同的區(qū)域，區(qū)分較為明顯，表明在有監(jiān)督的PLS-DA判別模型中，2組復(fù)方制劑中的化學(xué)成分存在差異。

為進(jìn)一步為確定引起XTG分組的差異標(biāo)志物，采用變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）對(duì)數(shù)據(jù)矩陣分析，VIP圖見圖5。PLS-DA模型中VIP值可直觀體現(xiàn)2個(gè)生產(chǎn)廠家的差異性成分，VIP值大于1的化合物對(duì)分類概括解釋率大于50%，對(duì)分類結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即為差異標(biāo)志物。由圖5可知，9（秦皮乙素）、7（新綠原酸）、3、18、17（菊苣酸）、14、10（咖啡酸）號(hào)峰的VIP值均大于1，為XTG的差異標(biāo)志物，可控制該制劑的質(zhì)量。

圖3 15批XTG樣品的HPLC指紋圖譜(A)及其對(duì)照指紋圖譜(B)

圖4 PLS-DA得分圖

2.4.6 共有峰歸屬 分別取“2.2.3”項(xiàng)下藥材溶液各20 μL，進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖6。通過(guò)比對(duì)單味藥材溶液和樣品溶液色譜峰的保留時(shí)間和最大吸收波長(zhǎng)，將21個(gè)共有峰進(jìn)行藥味歸屬。由圖6可得，1、2（鳥苷）、3號(hào)峰為4味藥材的共有成分；5、11、12、13、14、15、21（靛玉紅）號(hào)峰是君藥大青葉的特有成分；6、7（新綠原酸）號(hào)峰為君藥蒲公英的特有成分；8（秦皮甲素）、9（秦皮乙素）號(hào)峰是臣藥紫花地丁的特有成分；10（咖啡酸）、17（菊苣酸）號(hào)峰是蒲公英和紫花地丁的共有成分。

圖5 PLS-DAVIP值圖

2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，大青葉、蒲公英、紫花地丁和甘草具有顯著的解熱、抗炎、體內(nèi)外抗內(nèi)毒素活性。其中，君藥大青葉特征成分為靛苷類（靛藍(lán)、靛玉紅）；君藥蒲公英特征成分為菊苣酸、咖啡酸，菊苣酸是咖啡酸衍生物；臣藥紫花地丁特征成分為秦皮乙素、秦皮甲素，均屬于香豆素類化合物；甘草為方中佐使，具有調(diào)和諸藥的功效。有研究發(fā)現(xiàn)，靛苷類化合物[23-24]、咖啡酸及菊苣酸[25-26]、香豆素類化合物[27]及中藥甘草[28]均具抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等生物活性。因此，指紋圖譜指認(rèn)的7個(gè)化合物除鳥苷外，均具有顯著的抗炎活性。

為增強(qiáng)中藥質(zhì)量控制手段、質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與中藥有效性的關(guān)聯(lián)性，本實(shí)驗(yàn)基于中藥指紋圖譜研究和多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行初篩，尋找引起組間差異的差異標(biāo)志物，并以此為基礎(chǔ)利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)一步的尋找Q-Maker，做到量效合一。

圖6 藥材歸屬HPLC圖

2.5.1 活性成分靶點(diǎn)信息的收集 通過(guò)TCMSP、PubChem、Swiss Target Predict等中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)，共得到秦皮乙素、咖啡酸、新綠原酸和菊苣酸4個(gè)候選化合物的121個(gè)作用靶點(diǎn)。

2.5.2 疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集的建立 以“Inflammation”和“Fever”為關(guān)鍵詞搜索Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// www.genecards.org）獲得3404個(gè)疾病相關(guān)基因。

2.5.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心基因篩選結(jié)果分析 將活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集并去重，得到81個(gè)交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蛋白互作數(shù)據(jù)信息（圖7），構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。將String結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，并通過(guò)CytoHubba插件中的Degree算法篩選得到交互作用評(píng)分在前10的基因，提示這些基因在PPI中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。如圖8，前10的基因分別為、、、、、、、、、。

2.5.4 基因本體生物學(xué)過(guò)程（gene-ontology biology process，GO）功能富集分析 利用David 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)10個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO功能富集分析，以＜0.01表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GO富集分析根據(jù)＜0.01的條件篩選出51條條目，生物過(guò)程、細(xì)胞組成、分子功能分別為38、5、8條，導(dǎo)入微生信網(wǎng)站作圖，如圖9所示。其中，生物過(guò)程條目38個(gè)，主要涉及機(jī)體對(duì)UV-A（Ultraviolet Rays-A）的反應(yīng)、ERBB2信號(hào)通路、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控、對(duì)雌二醇的反應(yīng)等生物過(guò)程。分子功能條目8個(gè)，主要涉及一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑的活性、酶結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合等分子功能。細(xì)胞成分條目5個(gè)，主要涉及細(xì)胞溶質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、質(zhì)膜、核質(zhì)等細(xì)胞成分。

圖7 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖8 10個(gè)核心基因交互網(wǎng)絡(luò)圖

2.5.5 京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopediaof genes and genomes，KEGG）通路富集分析 利用David 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf. gov/）對(duì)10個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析，以＜0.01表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。KEGG通路富集分析根據(jù)＜0.01的條件篩選出57個(gè)KEGG富集條目，對(duì)57條通路進(jìn)行整合發(fā)現(xiàn)，主要涉及癌癥相關(guān)的信號(hào)通路、消炎清熱相關(guān)的信號(hào)通路及內(nèi)分泌相關(guān)的信號(hào)通路。如癌癥中的蛋白聚糖合成分解途徑、癌癥相關(guān)途徑、胰腺癌、前列腺癌等癌癥相關(guān)通路；磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（phosphateidylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase，PI3K-Akt）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路、Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（the Janus kinase-signal transducer and activator of tran-ions，JAK-STAT）信號(hào)通路、乙型肝炎、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、丙型肝炎、Toll樣受體信號(hào)通路等消炎清熱相關(guān)通路。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)與消炎清熱相關(guān)的信號(hào)通路及相對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行作表展示，結(jié)果見表1。

圖9 GO分析富集圖

表1 KEGG富集分析信息

2.5.6 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò) 將10個(gè)靶點(diǎn)蛋白、4個(gè)化合物及57條信號(hào)通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件繪制成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（圖10）。以化合物、靶點(diǎn)蛋白、信號(hào)通路的連接度為參考，發(fā)現(xiàn)4個(gè)化合物連接度差異不大，均可能是XTG的活性成分；MAPK1、PIK3CA、AKT1、EGFR、CCND1、SRC的連接度高于其他靶點(diǎn)，可能是XTG發(fā)揮藥效的關(guān)鍵靶點(diǎn)；57條信號(hào)通路差異性不大，均可能是XTG的關(guān)鍵信號(hào)通路。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方式和色譜條件的優(yōu)化

本研究分別考察了不同的提取方式、提取時(shí)間、提取溶劑、色譜柱品牌、流動(dòng)相體系及水相的添加劑、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫對(duì)色譜峰數(shù)量及分離情況的影響，最終確定以75%甲醇超聲提取30 min作為供試品制備方法。色譜柱選用Diamonsil C18（2）柱，以0.1%甲酸水溶液-25%甲醇乙腈梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm且柱溫為30 ℃時(shí)，色譜圖峰較多分離度良好。

菱形代表活性成分，方形代表通路，三角形代表基因靶點(diǎn)

3.2 HPLC指紋圖譜結(jié)果分析

本研究建立20批XTG HPLC指紋圖譜，共確認(rèn)21個(gè)共有峰，指認(rèn)了7個(gè)化合物，并將21個(gè)共有峰進(jìn)行藥味歸屬。采用相似性分析、聚類分析、PLS-DA 3種分析方法，對(duì)圖譜結(jié)果進(jìn)行分析。聚類分析將20批樣品可粗分為2大類；根據(jù)聚類分成的2類在相似度上存在差異，但總的來(lái)說(shuō)20批的相似度均大于0.94，表明XTG質(zhì)量均一穩(wěn)定；通過(guò)PLS-DA分析指出7個(gè)差異化合物，采用對(duì)照品指認(rèn)出其中4個(gè)化合物，分別為新綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸和菊苣酸。結(jié)果提示，這7個(gè)化合物影響樣品組間差異，可用來(lái)控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

3.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果分析

3.3.1 活性成分的篩選 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，咖啡酸、秦皮乙素、菊苣酸及新綠原酸聯(lián)接度差異不大，均可能是XTG的活性成分，建議作為XTG Q-Marker?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，咖啡酸、秦皮乙素、菊苣酸及新綠原酸均有不同程度抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒的生物活性[25-27]。

3.3.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的篩選 MAPK1、PIK3CA、AKT1、EGFR、CCND1、SRC這6個(gè)靶點(diǎn)可能是發(fā)揮藥效的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。基因編碼MAP激酶家族相關(guān)蛋白，MAPK1、MAPK3、MAPK8屬于絲裂原活化蛋白激酶通路家族，主要涉及細(xì)胞的存活、增殖、分化和凋亡等多種功能，可以促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)毒性急性肺損傷等相關(guān)炎性疾病的發(fā)生[29]。

AKT1在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中起重要作用，作為PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要中間分子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、存活和凋亡等[30]。基因編碼的蛋白質(zhì)是一種跨膜糖蛋白，該蛋白在肝細(xì)胞中作為丙型肝炎病毒的受體，并促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞進(jìn)入，與丙型肝炎的發(fā)生有關(guān)。

3.3.3 作用通路的篩選 57條信號(hào)通路（dgree: 3～10）中前27條信號(hào)通路聯(lián)接度相對(duì)較高（dgree＞5）主要涉及癌癥相關(guān)的信號(hào)通路和消炎清熱相關(guān)的通路，包括乙型肝炎、丙型肝炎、TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等。其中，TNF是致炎因子，不但參與急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)病過(guò)程，而且損害肺泡表面活性物質(zhì)系統(tǒng)[31]。

MAPK信號(hào)通路可調(diào)控炎癥基因表達(dá)，活化的MAPK能夠使細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生磷酸化而激活，從而調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)，產(chǎn)生不同的生理反應(yīng)[32]；研究表明，JAK-STAT在多種炎癥因子刺激下激活，進(jìn)而發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，影響巨噬細(xì)胞的分化和炎癥[33]?？赏ㄟ^(guò)調(diào)控JAK-STAT信號(hào)通路活性，調(diào)控癌細(xì)胞的遷移、侵襲和炎癥因子的分泌，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另外，F(xiàn)oxo信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡可調(diào)節(jié)能量代謝，從而達(dá)到清熱的作用。其中，F(xiàn)oxo信號(hào)通路參與許多細(xì)胞生理事件，例如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期控制、葡萄糖代謝、抗氧化應(yīng)激等，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝狀態(tài)。由此可推測(cè)，XTG可能通過(guò)作用于這些信號(hào)通路達(dá)到消炎清熱的作用。

3.4 整合分析

本研究依據(jù)劉昌孝院士提出的“質(zhì)量標(biāo)志物”的理念，采用指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合的方法分析預(yù)測(cè)XTG Q-Marker。通過(guò)建立XTG的指紋圖譜，從溯源性和可測(cè)性的角度對(duì)XTG進(jìn)行分析，指認(rèn)出鳥苷、新綠原酸、秦皮甲素、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸和靛玉紅7個(gè)成分。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從有效性的角度對(duì)其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)咖啡酸、秦皮乙素、菊苣酸和新綠原酸4個(gè)活性成分通過(guò)調(diào)控MAPK1、PIK3CA、AKT1、EGFR、CCND1、SRC等關(guān)鍵靶點(diǎn)，作用于乙型肝炎、丙型肝炎、TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等關(guān)鍵信號(hào)通路發(fā)揮藥效作用。

XTG由大青葉、蒲公英、紫花地丁、甘草4味中藥組成，具有清熱解毒，涼血消腫的功效。本論文基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)和篩選出4個(gè)差異成分秦皮乙素、新綠原酸、菊苣酸和咖啡酸，建議作為XTG Q-Marker。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Prediction of quality markers for Xiaoyan Tuire Granules based on HPLC fingerprint and network pharmacology

LI Cheng-cheng, YUAN Nan-nan, BAI Hua-fang, WANG Yuan, WEI Lan, SUN Li-xin

College of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Benxi 117004, China

To analyze and predict the potential Q-markers of Xiaoyan Tuire Granules (消炎退熱顆粒, XTG) based on fingerprints and network pharmacology methods.The fingerprints of 20 batches of XTG were established by using HPLC method with esculetin as a reference. Using “” (2012A version), 20 batches of samples were evaluated for similarity and common peaks were determined. By comparing with the chromatographic peaks of the single medicinal solution and the mixed reference solution, the common peaks were assigned, and the medicinal taste and the chemical components were assigned. Cluster analysis was used for classification, and the supervised model partial least squares method-discriminant analysis (PLS-DA) was used to screen out the main marker components that cause differences between groups. Using network pharmacology to screen and analyze the relevant targets and pathways of XTG, construct a “compound-target- pathway” network to predict the potential quality markers (Q-Marker) in XTG.The fingerprints of 21 common peaks were successfully established, and four different components were screened out as differential markers of XTG, namely esculetin, neochlorogenic acid, cichoric acid and caffeic acid, which were used as the research object of network pharmacology. The results of network pharmacology showed that the four different components were selected as potential quality markers.The established HPLC fingerprint analysis method has high accuracy and good stability, and reflects the overall chemical composition information of XTG more comprehensively and intuitively. Four chemical components that can be used as potential quality markers of XTG were screened out. It provides a reference for the comprehensive control of the quality of XTG, and also lays a foundation for the study of the substance basis of the drug efficacy of XTG and the exploration of the mechanism of action.

Xiaoyan Tuire Granules; HPLC; fingerprints; similarity analysis; cluster analysis; partial least square-discriminant analysis; network pharmacology; quality marker; esculetin; neochlorogenic acid; cichoric acid; caffeic acid

R283.6

A

0253 - 2670(2021)13 - 3885 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.012

2021-02-26

遼寧省教育廳“遼寧特聘教授滾動(dòng)支持項(xiàng)目”（遼教函[2018]35號(hào)）

李成成（1994—），女，碩士，研究方向?yàn)樗幬锓治觥el: (024)43520599 E-mail: lcc151886@163.com

孫立新（1967—），女，博士，教授，研究方向?yàn)樗幬锓治?。Tel: (024)43520599 E-mail: slx04@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]