馮玲玲，陳瓊，李玉夢(mèng)，梁景晗，王舟

華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079

人類(lèi)活動(dòng)的加劇和全球氣候的變暖使得世界各地湖泊富營(yíng)養(yǎng)化程度日益嚴(yán)重，藍(lán)藻水華事件頻繁爆發(fā)。藍(lán)藻水華產(chǎn)生的高密度藻類(lèi)危害水域中其他生物的生存與發(fā)展、破壞水域生態(tài)景觀，給漁業(yè)、旅游業(yè)、人類(lèi)生活等帶來(lái)嚴(yán)重的危害[1,2]。使用化學(xué)殺藻劑抑制藍(lán)藻生長(zhǎng)或殺滅藍(lán)藻是快速有效解決藍(lán)藻水華問(wèn)題的重要防治手段。現(xiàn)有的化學(xué)殺藻劑，如硫酸銅、高錳酸鉀及過(guò)氧化物等不是針對(duì)藻類(lèi)特異設(shè)計(jì)的，存在選擇性差、對(duì)其他生物毒性大等缺點(diǎn)，極大地限制了化學(xué)殺藻劑防治藻害效能的充分發(fā)揮[3]，因此，獲得選擇性高、毒性小的殺藻劑是現(xiàn)代殺藻劑創(chuàng)制研究的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)，研發(fā)新型的殺藻劑具有重要意義。

化學(xué)生物學(xué)的一個(gè)重要研究?jī)?nèi)容是以生物體中重要調(diào)控酶為靶酶，通過(guò)研究靶酶與配體之間的相互作用機(jī)理，進(jìn)而建立基于靶酶的農(nóng)藥或醫(yī)藥篩選模型，獲得作用于新靶點(diǎn)的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的醫(yī)藥及農(nóng)藥制劑[4–9]。運(yùn)用化學(xué)生物學(xué)研究策略和技術(shù)，以藻類(lèi)光合作用系統(tǒng)中重要調(diào)控酶為靶標(biāo)進(jìn)行抑制劑的設(shè)計(jì)與篩選是獲得新型殺藻劑的有效途徑之一。果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(Fructose-1,6-/sedoheptulose-1,7-bisphosphatase，Cy-FBP/SBPase)是藍(lán)藻光合作用中重要的調(diào)控酶，是尋找殺藻劑治理藍(lán)藻水華污染問(wèn)題的一個(gè)潛在靶標(biāo)。研究Cy-FBP/SBPase的酶學(xué)性質(zhì)、酶與配體的相互作用，是建立基于靶酶的殺藻劑篩選模型的關(guān)鍵。

化學(xué)與生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科的交叉融合大大促進(jìn)了化學(xué)生物學(xué)學(xué)科的建立與發(fā)展。明顯的標(biāo)志是國(guó)際上著名大學(xué)如哈佛大學(xué)、耶魯大學(xué)、康奈爾大學(xué)等紛紛將化學(xué)系改名為化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)系[10]。我國(guó)自2000年由國(guó)家自然科學(xué)基金委化學(xué)部主持召開(kāi)“化學(xué)生物學(xué)”研討會(huì)以來(lái)，化學(xué)生物學(xué)科學(xué)研究得到了飛速發(fā)展，化學(xué)生物學(xué)專(zhuān)業(yè)人才的需求也急劇增加，因此國(guó)內(nèi)多所高校相繼設(shè)立了化學(xué)生物學(xué)本科專(zhuān)業(yè)或化學(xué)生物學(xué)特色人才培養(yǎng)基地[11–13]?；瘜W(xué)生物學(xué)本科教學(xué)的理論課程體系得到了迅速發(fā)展和逐步完善，但化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程建設(shè)和發(fā)展相對(duì)滯后[14–17]。因此開(kāi)發(fā)適合本科生高階發(fā)展所需要的化學(xué)生物學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，是建設(shè)及完善高等院?；瘜W(xué)生物學(xué)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程體系亟需解決的問(wèn)題。

前期我們報(bào)道了Cy-FBP/SBPase的晶體結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)、酶與配體的相互作用、抑制篩選等研究成果[18–20]?；诖?，本文結(jié)合化學(xué)專(zhuān)業(yè)高年級(jí)本科生的知識(shí)背景、發(fā)展需求，將我們?cè)诳蒲蓄I(lǐng)域中取得的系列研究成果設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化為一個(gè)化學(xué)生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括通過(guò)異源蛋白的表達(dá)、純化獲得靶酶Cy-FBP/SBPase，然后測(cè)定靶酶的純度及含量，測(cè)定底物、金屬離子及抑制劑等配體對(duì)靶酶活性的影響，探討靶酶的酶學(xué)性質(zhì)、酶與配體之間的相互作用。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的訓(xùn)練，學(xué)生可以掌握以生物體重要調(diào)控酶為靶標(biāo)建立抑制劑篩選模型的研究思路、研究方法及重要實(shí)驗(yàn)技術(shù)，拓展思維視野，提高分析問(wèn)題及解決問(wèn)題的能力，提升綜合運(yùn)用化學(xué)生物學(xué)知識(shí)的能力，為今后從事化學(xué)生物學(xué)科學(xué)研究活動(dòng)及其他相關(guān)領(lǐng)域的研究工作奠定基礎(chǔ)，同時(shí)有助于增強(qiáng)科研服務(wù)社會(huì)的意識(shí)及社會(huì)責(zé)任感。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

(1) 學(xué)習(xí)并掌握通過(guò)異源蛋白的表達(dá)、純化獲得靶酶的原理及方法，掌握運(yùn)用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(SDS-PAGE)分析蛋白純度及大小的方法以及Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法。

(2) 學(xué)習(xí)無(wú)機(jī)磷法測(cè)定Cy-FBP/SBPase活性的方法，掌握酶學(xué)性質(zhì)、酶與配體相互作用的實(shí)驗(yàn)分析方法。

(3) 掌握紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、冷凍離心機(jī)及蛋白質(zhì)電泳儀等儀器設(shè)備的基本原理及使用方法。

(4) 學(xué)習(xí)基于靶酶建立抑制劑篩選模型研究中相關(guān)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，提升分析及解決問(wèn)題的能力，增強(qiáng)對(duì)化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的綜合應(yīng)用能力，增強(qiáng)科研服務(wù)社會(huì)的意識(shí)及社會(huì)責(zé)任感。

2 實(shí)驗(yàn)原理

2.1 Cy-FBP/SBPase的制備

以大腸桿菌為代表的原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作方便、需時(shí)短、表達(dá)量大等優(yōu)點(diǎn)，成為生物合成外源蛋白的首選。通過(guò)基因重組技術(shù)，將Cy-FBP/SBPase基因fbp克隆到帶有組氨酸標(biāo)簽(His-tag)的pET-28a(+)載體上獲得重組載體pET-fbp，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，在異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside，IPTG)的誘導(dǎo)下生物合成目標(biāo)蛋白。

Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂是一種通過(guò)親和層析法分離純化帶有His-tag重組蛋白的介質(zhì)，His-tag中組氨酸殘基與鎳離子結(jié)合具有較高的特異性和親和性。親和純化時(shí)含有His-tag的蛋白與Ni-NTA結(jié)合，而不帶His-tag標(biāo)簽的蛋白則被洗滌下去。結(jié)合在介質(zhì)中的目標(biāo)蛋白再用高濃度的咪唑洗脫，從而得到高純度的目的蛋白。

2.2 Cy-FBP/SBPase的純度、大小及含量分析

SDS-PAGE法不受蛋白質(zhì)本身所帶電荷、形狀的影響，電泳結(jié)果只與蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān)，可以根據(jù)蛋白的分子量不同將蛋白質(zhì)各組分分開(kāi)，從而定性及半定量地分析Cy-FBP/SBPase蛋白的純度及大小。

Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理是蛋白質(zhì)與染料考馬斯亮蘭G-250結(jié)合后，染料顏色由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色，染料的最大吸收峰從465 nm變?yōu)?95 nm?；?95 nm下測(cè)定的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度成正比，從而計(jì)算得出樣品中蛋白質(zhì)的含量。這一方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高。

2.3 Cy-FBP/SBPase的酶活性測(cè)定、酶學(xué)性質(zhì)、配體與酶相互作用

采用磷試劑顯色法直接測(cè)定Cy-FBP/SBPase催化底物果糖-1,6-二磷酸(Fructose-1,6-biphosphate，F(xiàn)BP)產(chǎn)生的無(wú)機(jī)磷，方法簡(jiǎn)單、高效快捷，適合用于Cy-FBP/SBPase抑制劑的高通量篩選。通過(guò)測(cè)定底物、金屬離子濃度(鎂離子和錳離子)、抑制劑對(duì)Cy-FBP/SBPase活性的影響，探討Cy-FBP/SBPase酶學(xué)性質(zhì)、酶與配體的相互作用[18–20]。

3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

3.1 實(shí)驗(yàn)試劑

抑制劑D7為本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的化合物小分子。Imidazloe、MgCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、NaCl等為分析純，購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司(中國(guó))。酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉、Tris-Base、IPTG、氨芐青霉素、二硫蘇糖醇(DTT)、sodium lauryl sulfate (SDS)、過(guò)硫酸銨等為分析純，購(gòu)自Biosharp。金屬離子溶液儲(chǔ)存濃度為10 mmol·L?1，使用時(shí)用去離子水稀釋至所需實(shí)驗(yàn)濃度。底物FBP、親和樹(shù)脂Ni-NTA、SDS-PAGE蛋白分子質(zhì)量Marker及其他試劑在保證實(shí)驗(yàn)效果的前提下盡量購(gòu)買(mǎi)國(guó)產(chǎn)可替代產(chǎn)品，比如廣州鼎國(guó)生物、合肥博美生物學(xué)科技、新海基因等國(guó)內(nèi)廠(chǎng)家生產(chǎn)的相關(guān)試劑。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用水均為去離子水。

3.2 實(shí)驗(yàn)儀器

冷凍高速離心機(jī)5810R (Eppendorf)、凝膠成像儀(BIO-RAD)，酶標(biāo)儀SpectraMax M5 (Molecular Device)，紫外分光光度計(jì)Smart SpecTMPlus (BIO-RAD)，DYY-8C型雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源(北京市六一儀器廠(chǎng))。

4 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

4.1 重組酶Cy-FBP/SBPase的制備

首先挑取有重組表達(dá)質(zhì)粒的單菌落，接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100 μg·mL?1)，37 °C振蕩過(guò)夜，培養(yǎng)12–16 h。然后取過(guò)夜的培養(yǎng)液按1%比例接入新鮮LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100 μg·mL?1)中，37 °C振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6–0.8。加入終濃度為0.3 mmol·L?1的IPTG，22 °C振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)8–10 h。然后，離心收集大腸桿菌細(xì)胞，加入裂解液(10 mmol·L?1Tris-HCl，pH 8.5，0.5 mol·L?1NaCl)將菌體重懸，超聲破碎細(xì)胞，釋放蛋白。離心制備用于親和層析純化所需要的上清粗酶提取液。

將制備好的上清粗酶提取液與Ni-NTA親和樹(shù)脂在冰浴條件下孵育2–3 h，然后依次分別在50 mmol·L?1、250 mmol·L?1咪唑溶液洗脫，再經(jīng)過(guò)脫鹽處理得到目標(biāo)蛋白，?20 °C存儲(chǔ)在50%甘油溶液中備用[18,19]。

4.2 蛋白質(zhì)的純度、大小及含量分析

用SDS-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)Cy-FBP/SBPase的純度和大小[18,19]。實(shí)驗(yàn)步驟大致為：(1) 制備15 mL 12%的分離膠(H2O 4.9 mL，30%丙烯酰胺6.0 mL，pH 8.8 Tris-HCl緩沖液3.8 mL，10% SDS 150 μL，10%過(guò)硫酸銨150 μL，6 μL TEMED)；(2) 制備5%的積層膠：H2O 3.4 mL，30%丙烯酰胺0.84 mL，pH 6.8 Tris-HCl緩沖液0.63 mL，10% SDS 150 μL，10%過(guò)硫酸銨50 μL，TEMED 5 μL；(3) 蛋白及菌液樣品的制備。取蛋白質(zhì)樣品8 μL，加入10 ×蛋白上樣緩沖液2 μL，混勻后95 °C溫育10 min變性。(4) 上樣，電泳，電壓100 V。(5) 染色及脫色：電泳結(jié)束后，取出蛋白膠，置于考馬斯亮藍(lán)染色液中染色20 min左右。然后將蛋白膠置于脫色劑中脫色結(jié)束(脫色時(shí)間根據(jù)脫色效果確定)。(6) 分析：凝膠成像儀分析SDS-PAGE結(jié)果。

蛋白含量用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒(Tiangen Biotech)提供的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)測(cè)定。首先取1 mg·mL?1的牛血清蛋白(BSA) 0、1、2、3、4、5 μL BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后加入PBS補(bǔ)齊總體積為15 μL，混合均勻后加入考馬斯亮藍(lán)染色劑285 μL，反應(yīng)10 min，以每孔100 μL加入到96孔板中，測(cè)定595 nm處的吸光度，制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。然后取1 μL、3 μL待測(cè)目標(biāo)蛋白溶液，用PBS補(bǔ)齊體積15 μL，按上述方法，測(cè)定595 nm處的吸光度，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合的方程計(jì)算目標(biāo)蛋白含量。

4.3 Cy-FBP/SBPase酶活性的測(cè)定、酶學(xué)性質(zhì)、酶與配體相互作用的分析

以100 μmol·L?1磷酸二氫鉀溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)Cy-FBP/SBPase催化特定底物FBP釋放出無(wú)機(jī)磷量，計(jì)算酶的活性[18,19]。

首先取100 μmol·L?1磷酸二氫鉀溶液0、10、20、30、40、50 μL，然后分別加入去離子水補(bǔ)齊總體積為100 μL?；靹蚝?，取37.5 μL至干凈的1.5 mL離心管。每個(gè)離心管中加入375 μL顯色劑(鉬酸銨溶液與孔雀綠溶液的體積比1 : 3配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)，顯色10 min后，以每孔100 μL加入到96孔板中，測(cè)定620 nm處的吸光度，制作磷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目“改變底物濃度對(duì)Cy-FBP/SBPase活性的影響”的操作步驟為：在反應(yīng)體系里加入MgCl215 mmol·L?1，DTT 10 mmol·L?1，pH 8.5 Tris-HCl 50 mmol·L?1，0.04 μg Cy-FBP/SBPase，加水補(bǔ)足22.5 μL，混勻后，分別加入底物FBP 0，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2 mM啟動(dòng)反應(yīng)，分別反應(yīng)10 min。然后加入12.5 μL HClO4終止反應(yīng)，再加入375 μL顯色劑顯色10 min，以每孔100 μL加入到96孔板中，測(cè)定620 nm處的吸光度，根據(jù)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合方程計(jì)算Cy-FBP/SBPase催化產(chǎn)生的無(wú)機(jī)磷的量，從而計(jì)算酶的活性。Cy-FBP/SBPase活力單位U的定義是每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol·L?1無(wú)機(jī)磷所需要的Cy-FBP/SBPase酶量為一個(gè)酶活力單位。

然后通過(guò)單一因子變化分析法，分別改變金屬離子濃度(鎂離子和錳離子)、抑制劑濃度，測(cè)定金屬離子、抑制劑對(duì)Cy-FBP/SBPase活性的影響。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

5.1 Cy-FBP/SBPase的制備、純度及含量的分析

為了分析通過(guò)生物合成法獲得Cy-FBP/SBPase的純度，以未經(jīng)pET28a(+)載體誘導(dǎo)的細(xì)胞的粗酶液為對(duì)照，通過(guò)SDS-PAGE分析重組載體未誘導(dǎo)細(xì)胞的粗酶液、重組載體誘導(dǎo)細(xì)胞的粗酶液、重組細(xì)胞裂解后的上清液、純化時(shí)的流川液、50 mmol·L?1咪唑洗脫液及250 mmol·L?1咪唑洗脫液中Cy-FBP/SBPase的含量情況(圖1)。從圖1中可以看出，載體pET28a(+)未誘導(dǎo)細(xì)胞的粗酶液中沒(méi)有目標(biāo)蛋白的表達(dá)(條帶1)，重組載體pET-fbp沒(méi)有IPTG誘導(dǎo)則沒(méi)有目標(biāo)蛋白的明顯表達(dá)(條帶2)。IPTG誘導(dǎo)之后，目標(biāo)蛋白大量表達(dá)(條帶3)，而且大部分表達(dá)的蛋白存在上清液中，呈現(xiàn)可溶性狀態(tài)(條帶4)。流穿液及50 mmol·L?1咪唑洗脫液中只有少量的目標(biāo)蛋白(條帶5和6)，說(shuō)明有His-tag的目標(biāo)蛋白和Ni-NTA親和樹(shù)脂結(jié)合效果比較好；而250 mmol·L?1咪唑洗脫液中有非常純的Cy-FBP/SBPase，純度達(dá)到95%以上(條帶7)。因此可以說(shuō)明異源蛋白的表達(dá)及純化是成功的，而且通過(guò)蛋白含量的測(cè)定，結(jié)果顯示1 L培養(yǎng)基可以獲得30 mg Cy-FBP/SBPase。

圖1 用12% SDS-PAGE分析Cy-FBP/SBPase的表達(dá)及純化情況

5.2 底物FBP對(duì)Cy-FBP/SBPase活性的影響

底物濃度是影響酶活性的直接因素。為了分析底物濃度對(duì)Cy-FBP/SBPase活性的影響，在一定酶濃度下，改變底物濃度，測(cè)定酶活性。結(jié)果如圖2所示。酶活性與底物濃度的關(guān)系可以通過(guò)Hill方程擬合，得到Cy-FBP/SBPase最大反應(yīng)速度Vmax為15.02 ± 0.51 U·mg?1，米氏常數(shù)Km為0.083 ±0.01 mmol·L?1。米氏常數(shù)是酶的特征常數(shù)，可表征酶與底物的結(jié)合能力。Hill指數(shù)為2，說(shuō)明一個(gè)酶單體分子可能結(jié)合2個(gè)底物分子，這和我們獲得的晶體結(jié)構(gòu)是相符的[19]。

圖2 底物FBP對(duì)Cy-FBP/SBPase活性的影響

5.3 金屬離子對(duì)Cy-FBP/SBPase活性的影響

根據(jù)金屬離子與酶結(jié)合的緊密程度，可以將酶分為金屬酶和金屬激酶。對(duì)于金屬酶而言，金屬離子和酶緊密結(jié)合，蛋白形成過(guò)程中金屬離子就已經(jīng)存在于酶中。而對(duì)于金屬激酶，金屬離子和酶結(jié)合并不那么緊密，但酶發(fā)揮催化作用時(shí)，加入金屬離子，可以使酶的活性極大的提高。如圖3所示，當(dāng)加入金屬鎂離子及錳離子時(shí)，Cy-FBP/SBPase的催化活性迅速提高，說(shuō)明Cy-FBP/SBPase是金屬激酶，但鎂離子及錳離子對(duì)Cy-FBP/SBPase的影響又是不同的。隨著鎂離子濃度的增加，Cy-FBP/SBPase的催化活性逐漸升高，然后達(dá)到最大值，之后再提高鎂離子濃度，對(duì)酶的活性影響不是很明顯。但是錳離子在很低濃度下可以迅速提高酶的活性，之后錳離子濃度的升高則會(huì)抑制酶的活性，預(yù)示著鎂離子、錳離子與Cy-FBP/SBPase有著不同的作用方式[18,19]。

圖3 金屬離子對(duì)Cy-FBP/SBPase活性的影響

5.4 抑制劑對(duì)Cy-FBP/SBPase活性的影響

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，我們獲知Cy-FBP/SBPase的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，Cy-FBP/SBPase與不同金屬離子之間的關(guān)系?；趯?duì)Cy-FBP/SBPase酶學(xué)性質(zhì)的認(rèn)識(shí)，可以建立以Cy-FBP/SBPase為靶點(diǎn)的抑制劑篩選模型，研究抑制劑對(duì)Cy-FBP/SBPase的抑制動(dòng)力學(xué)。如圖4所示，我們篩選獲得的化合物小分子D7能抑制Cy-FBP/SBPase的催化活性，隨著化合物濃度的升高，抑制效率逐漸增大，IC50為31.19 ±3.45 μmol·L?1。在此基礎(chǔ)上，可以設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，比較不同抑制劑的IC50，分析抑制劑的結(jié)構(gòu)與抑制活性的關(guān)系，獲取抑制劑構(gòu)效關(guān)系的規(guī)律，為篩選基于靶酶 Cy-FBP/SBPase 的殺藻劑奠定了基礎(chǔ)[20]。

圖4 抑制劑對(duì)Cy-FBP/SBPase活性影響

6 實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式、教學(xué)設(shè)計(jì)及教學(xué)安排

本綜合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的主題面向社會(huì)需求，結(jié)合化學(xué)生物學(xué)科研成果，易于激發(fā)學(xué)生科研服務(wù)社會(huì)的意識(shí)及增強(qiáng)社會(huì)責(zé)任感。在強(qiáng)大內(nèi)動(dòng)力和社會(huì)需求的驅(qū)動(dòng)下，學(xué)生帶著目標(biāo)學(xué)習(xí)，可以很好地綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)，建立并掌握化學(xué)生物學(xué)思維方式、實(shí)驗(yàn)技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為28學(xué)時(shí)，每組學(xué)生最多8人。每組8名學(xué)生可以自由組合，分2人一小組完成相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。教學(xué)模式、教學(xué)設(shè)計(jì)及教學(xué)安排建議如下：

(1) 閱讀文獻(xiàn)：閱讀靶向酶的藥物篩選模型建立的相關(guān)文獻(xiàn)并繪制思維導(dǎo)圖，本部分設(shè)計(jì)為4個(gè)學(xué)時(shí)。首先實(shí)驗(yàn)教師準(zhǔn)備10篇靶向酶的藥物篩選方面的最新研究性文獻(xiàn)，然后每位學(xué)生至少閱讀其中2篇，這樣可以保證文獻(xiàn)的質(zhì)量和提高學(xué)生選擇文獻(xiàn)的效率，也給學(xué)生一定的自主選擇的機(jī)會(huì)。通過(guò)文獻(xiàn)的閱讀，繪制思維導(dǎo)圖，總結(jié)靶向酶的藥物篩選模型建立的研究思路、技術(shù)路線(xiàn)、關(guān)鍵技術(shù)及方法，初步構(gòu)建藥物篩選模型的思維框架，完成信息輸入過(guò)程，并以小組討論和個(gè)人匯報(bào)的形式完成信息輸出過(guò)程，教師或助教參與并引導(dǎo)信息輸出過(guò)程。通過(guò)這4個(gè)學(xué)時(shí)的學(xué)習(xí)，學(xué)生可以提升閱讀科研文獻(xiàn)的能力、了解化學(xué)生物學(xué)的最新研究進(jìn)展、研究思路和涉及的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，同時(shí)還可以提升邏輯思維能力、傾聽(tīng)能力及語(yǔ)言表達(dá)能力。

(2) 多個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的靈活安排與自主選擇相結(jié)合。本部分為24學(xué)時(shí)。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置2個(gè)必選實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(14學(xué)時(shí))、2個(gè)任選實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(8學(xué)時(shí))及2個(gè)說(shuō)課形式完成的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(2學(xué)時(shí))。

必選實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目1為重組酶Cy-FBP/SBPase的制備。這部分實(shí)驗(yàn)是后續(xù)所有實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，但耗時(shí)較長(zhǎng)、步驟較多、間隔時(shí)間較長(zhǎng)。建議這部分內(nèi)容中挑取單菌落、接種，培養(yǎng)12–16 h；再擴(kuò)大培養(yǎng)操作，繼續(xù)培養(yǎng)3 h左右；然后誘導(dǎo)操作、誘導(dǎo)培養(yǎng)8–10 h，收集細(xì)胞、破碎細(xì)胞，直至制備出用于親和層析純化所需要的上清粗酶提取液等實(shí)驗(yàn)內(nèi)容由教師或助教完成。學(xué)生可以現(xiàn)場(chǎng)觀摩這部分的操作，或者由教師或助教將操作制作短視頻，發(fā)給學(xué)生線(xiàn)上觀看學(xué)習(xí)。

然后，學(xué)生可以從親和層析純化蛋白開(kāi)始進(jìn)行蛋白制備的實(shí)驗(yàn)操作。由于親和層析法制備蛋白制備這一步是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，同時(shí)，Ni-NTA親和層析法獲得蛋白的技術(shù)也是化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)必備技能，重要且耗時(shí)較長(zhǎng)，所以建議這一必選實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為8學(xué)時(shí)。

必選實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目2為用SDS-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)Cy-FBP/SBPase的純度和大小，這是判斷制備蛋白的質(zhì)量及設(shè)計(jì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這一實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)設(shè)定為必選實(shí)驗(yàn)，耗時(shí)較長(zhǎng)，建議6學(xué)時(shí)。

2個(gè)任選實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目是從Braford方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量、底物濃度對(duì)Cy-FBP/SBPase酶活性的影響、金屬離子對(duì)Cy-FBP/SBPase酶活性的影響、抑制劑對(duì)Cy-FBP/SBPase酶活性的影響等項(xiàng)目中任選2個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目作為實(shí)操實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，完成需要的相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作，分析、討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。建議每個(gè)項(xiàng)目4學(xué)時(shí)，共8學(xué)時(shí)。如果學(xué)生能自己合成并表征抑制劑D7，從而對(duì)化學(xué)生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)會(huì)有更為完整的認(rèn)識(shí)，凸顯化學(xué)生物學(xué)交叉學(xué)科的特性，建議和有機(jī)合成組的教師進(jìn)行協(xié)商，盡可能讓有機(jī)合成實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目和化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目相互銜接，讓學(xué)生在有限的學(xué)習(xí)時(shí)間中獲得更多的技能訓(xùn)練和能力提升。

剩余2未選的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目以說(shuō)課形式展示實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的思路等，建議每個(gè)項(xiàng)目1學(xué)時(shí)，共2學(xué)時(shí)。

(3) 實(shí)驗(yàn)管理為開(kāi)放式管理模式。以每組8名學(xué)生為單位，其中可以自由組合組成2人小組，學(xué)生可以根據(jù)自己的時(shí)間自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、安排實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的開(kāi)始時(shí)間、實(shí)驗(yàn)進(jìn)度及完成時(shí)間。教師對(duì)學(xué)生設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的合理性進(jìn)行審核，實(shí)驗(yàn)采用預(yù)約制，以便實(shí)驗(yàn)教師提前統(tǒng)籌安排和協(xié)調(diào)，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料并進(jìn)行指導(dǎo)，確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，及時(shí)解決實(shí)驗(yàn)中的問(wèn)題。

(4) 多元化考核評(píng)價(jià)方式。在本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中學(xué)生為主體，教師在每個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行必要的引導(dǎo)?？己嗽u(píng)價(jià)方式采用過(guò)程評(píng)價(jià)和最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合，以及教師評(píng)價(jià)、小組互評(píng)及個(gè)人自評(píng)相結(jié)合的形式，全方位提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?、思維能力、表達(dá)能力、評(píng)價(jià)能力及團(tuán)隊(duì)精神。

7 結(jié)語(yǔ)

本綜合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以學(xué)科發(fā)展及專(zhuān)業(yè)人才需求為牽引，立足化學(xué)生物學(xué)科研前沿，結(jié)合化學(xué)學(xué)院本科三年級(jí)學(xué)生的知識(shí)背景、成長(zhǎng)特點(diǎn)，將科研成果轉(zhuǎn)化為本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，不斷完善并充實(shí)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，符合華中師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)改革的基本思路。學(xué)生通過(guò)這一綜合創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的訓(xùn)練，拓展思維視角，提高分析問(wèn)題及解決問(wèn)題的能力，提高綜合運(yùn)用知識(shí)的能力，為今后從事化學(xué)生物學(xué)科研活動(dòng)及其他相關(guān)領(lǐng)域的研究工作奠定基礎(chǔ)。這種將前沿科技成果、先進(jìn)的科研理念及實(shí)驗(yàn)技術(shù)等轉(zhuǎn)化為本科生高階實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的科研與教學(xué)的交叉融合將有助于促進(jìn)化學(xué)生物學(xué)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程的建設(shè)及完善。