陳 能，姚 楠

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院骨科，廣東 廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院骨科，廣東 珠海 519000；3.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510095）

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種發(fā)生在膝關(guān)節(jié)的退行性疾病，病理表現(xiàn)為滑膜炎性增生，軟骨退變等，臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限等。既往已有多項(xiàng)動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)KOA的發(fā)生發(fā)展受多種細(xì)胞因子影響，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metallo Proteinase，MMP）在KOA關(guān)節(jié)軟骨的破壞中起主要作用；前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）是炎性致痛因子；環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase，COX-2）是催化PG的合成的誘導(dǎo)酶，并參與了KOA炎癥反應(yīng)；神經(jīng)生長因子（Nerve Growth Factor，NGF）與神經(jīng)病理性疼痛及炎性疼痛均有關(guān)［1-2］。本研究觀察補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥學(xué)清對(duì)KOA滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞MMP13、PGE2、COX-2、NGF基因表達(dá)的影響，探討治療KOA的作用機(jī)制［3］。

1 研究對(duì)象及分組

選取在廣東省第二中醫(yī)院骨科住院的擬行全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的KOA患者。西醫(yī)診斷參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)2010年制定的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。

2 手術(shù)取材

術(shù)中取出病變滑膜組織，在完成股骨遠(yuǎn)端截骨后取出股骨髁軟骨，軟骨厚度不小于1 mm，盡快轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。

3 實(shí)驗(yàn)材料

主要實(shí)驗(yàn)儀器：SmartSpec plus 核酸蛋白測(cè)定儀（Bio-Rad公司）；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司），IQTM5型RT-qPCR儀（Bio-Rad公司）。

藥物和試劑：補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊（廣東省第二中醫(yī)院制劑室）；重組人IL-1β試劑（Peprotech公司）；First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo公司）；MaximaTM SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2×）（Thermo Fisher Scientific公司）；PCR特異性引物（上海英濰捷基貿(mào)易有限公司）。

4 實(shí)驗(yàn)方法

原代滑膜細(xì)胞培養(yǎng)?；そM織剪切碎放入培養(yǎng)皿中，DPBS溶液清洗棄上清液后加0.25%胰酶1 mL，靜置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱60 min，取出棄胰酶，加入10%FBS的DMEM 2mL，然后靜置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長達(dá)瓶底90%以上后，用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代，然后繼續(xù)用10%FBS的DMEM培養(yǎng)。

原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)。軟骨組織剪切成碎塊放入培養(yǎng)皿，DPBS溶液清洗棄上清液后加入0.25%胰酶1mL，靜置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱30min，然后棄上清液，加入0.02%II型膠原酶，靜置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜后，用100μm濾網(wǎng)過濾，加入10%FBS的DMEM，1600rpm離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀用10%FBS的DMEM培養(yǎng)，待細(xì)胞生長達(dá)瓶底90%以上后，用0.25%胰酶消化傳代，然后繼續(xù)用10%FBS的DMEM培養(yǎng)［5-7］。

含藥血清制備［5-7］。SPF級(jí)別SD雌性大鼠10只，體質(zhì)量為180～220g。把大鼠分成空白組、含藥血清組，每組5只。根據(jù)動(dòng)物與人之間藥物劑量換算，補(bǔ)腎強(qiáng)筋組每1kg予以0.243g生藥補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊溶液灌胃，空白組予生理鹽水灌胃。所有大鼠連續(xù)7天每天灌胃1次，然后行腹主動(dòng)脈取血，然后按3000rpm離心5min，棄上清液，56℃水浴30min滅活，經(jīng)0.45μm濾膜抽濾，分裝，置于-80℃冰箱保存，即為空白血清和含藥血清。

細(xì)胞造模及分組［4］。將第3代細(xì)胞按每孔1×105個(gè)細(xì)胞密度種植于6孔板（n=6），培養(yǎng)至融合度約達(dá)80%時(shí)，棄培養(yǎng)基，用DPBS清洗后，進(jìn)行分組處理。正常組為DMEM培養(yǎng)基+10%空白血清；OA組為DMEM培養(yǎng)基+10%空白血清，加入50ng/mL IL-1β；含藥血清組為DMEM培養(yǎng)基+10%含藥血清，加入50ng/mL IL-1β。連續(xù)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。

RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞PGE2、COX-2、NGF、MMP-13的基因表達(dá)。首先采用Trigol、異丙醇和氯仿等試劑提取滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞總RNA。用First Strand cDNA Synthesis Kit提供的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，加入上述提取的總RNA，合成First-Strand cDNA?；蛞镌O(shè)計(jì)利用Primer6.0生物軟件。然后在定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增和熔解曲線分析，反應(yīng)結(jié)束后記錄Ct值，運(yùn)用2-△△Ct法分析各組基因相對(duì)表達(dá)量。

5 結(jié) 果

滑膜細(xì)胞基因表達(dá)比較。與OA組比較，正常組、含藥血清組PGE2、NGF、COX-2、MMP-13基因表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，含藥血清組PGE2、NGF、COX-2、MMP-13基因表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組滑膜細(xì)胞因子基因表達(dá)比較 （n=6，±s）

表1 各組滑膜細(xì)胞因子基因表達(dá)比較 （n=6，±s）

注：與OA組比較，*P＜0.05；與正常組比較，△P＜0.05。

組別 PGE2 NGF COX-2 MMP-13正常組 1.00±0.40*1.00±0.42*1.00±0.40*1.00±0.44*OA組 5.36±1.81 4.59±0.99 4.32±0.81 6.43±1.79含藥血清組2.42±0.39*△2.53±0.40*△2.36±0.56*△ 2.87±0.73*△

軟骨細(xì)胞基因表達(dá)比較。與OA組比較，正常組、含藥血清組PGE2、COX-2、、MMP-13基因表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與正常組比較，含藥血清組PGE2、COX-2、、MMP-13基因表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組軟骨細(xì)胞NGF表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組軟骨細(xì)胞因子基因表達(dá)比較 （n=6，±s）

表2 各組軟骨細(xì)胞因子基因表達(dá)比較 （n=6，±s）

注：與OA組比較，*P＜0.05；與正常組比較，△P＜0.05。

組別 PGE2 NGF COX-2 MMP-13正常組 1.00±0.33*1.00±0.13 1.00±0.29*1.00±0.34*OA組 3.21±1.10 1.03±0.30 7.48±2.15 3.61±0.91含藥血清組1.56±0.33*△1.21±0.44 3.32±0.79*△2.06±0.53*△

6 討 論

正常狀態(tài)下，膝關(guān)節(jié)滑膜可產(chǎn)生滑液，滑液主要發(fā)揮潤滑關(guān)節(jié)腔及吞噬物質(zhì)的作用，軟骨由軟骨細(xì)胞、纖維和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，細(xì)胞外基質(zhì)能保護(hù)軟骨細(xì)胞使其不與關(guān)節(jié)腔直接接觸。KOA發(fā)生時(shí)，關(guān)節(jié)滑膜發(fā)生炎癥反應(yīng)，釋放出炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子等物質(zhì)［8］，使膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境處于炎性狀態(tài)，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)持續(xù)性地發(fā)生降解，當(dāng)達(dá)到一定程度時(shí)軟骨細(xì)胞暴露于炎性環(huán)境中，使軟骨細(xì)胞逐漸失去活性，甚至死亡，最終軟骨破損。此外，KOA關(guān)節(jié)腔內(nèi)物質(zhì)中不乏多種致痛因子，這些因子刺激神經(jīng)感受器，引起了疼痛［9-10］。研究表明，KOA膝關(guān)節(jié)滑膜、軟骨中一些細(xì)胞因子水平的升高影響了病情，王培等［11］研究表明COX-2mRNA在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎病變初期滑膜細(xì)胞中表達(dá)水平較高。StoppielloLA等［12］發(fā)現(xiàn)KOA患者膝關(guān)節(jié)滑膜中NGF的表達(dá)升高，且與疼痛相關(guān)，而PecchiE等［13］研究采用炎性因子刺激軟骨細(xì)胞時(shí)，也會(huì)使NGF表達(dá)升高。本研究使用重組人IL-1β刺激復(fù)制滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞OA模型，結(jié)果表明上述因子基因表達(dá)確實(shí)有不同程度的升高，這與以往研究結(jié)果相符。

KOA屬中醫(yī)“痹證”范疇。潘建科等［14］通過數(shù)據(jù)挖掘分析表明具有補(bǔ)腎、活血功效的中藥是治療KOA內(nèi)服處方的主要成分。補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊由補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)中藥組成，既能補(bǔ)肝腎之不足以滋養(yǎng)筋骨，也能通局部之淤阻以順暢氣血，從而發(fā)揮緩解膝關(guān)節(jié)疼痛，改善關(guān)節(jié)活動(dòng)功能的功效。研究表明，補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊能有效改善膝關(guān)節(jié)滑液中IL-1β、TNF-α、PGE2水平以及血清PGE2水平［15］，補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清可顯著降低軟骨細(xì)胞上清液NO和PGE2水平，并顯著降低軟骨細(xì)胞COX-2、iNOS、MMP-1、MMP-13 mRNA表達(dá)［5］。研究對(duì)該藥治療KOA的作用機(jī)制進(jìn)行了補(bǔ)充，結(jié)果表明補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清對(duì)滑膜細(xì)胞PGE2、COX-2、MMP-13、NGF基因表達(dá)，對(duì)軟骨細(xì)胞PGE2、COX-2、MMP-13基因表達(dá)均有一定程度調(diào)節(jié)作用，但對(duì)于軟骨細(xì)胞NGF基因表達(dá)無明顯調(diào)節(jié)作用。

因此，補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊治療KOA的作用可能與調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞PGE2、COX-2、MMP-13、NGF以及軟骨細(xì)胞PGE2、COX-2、MMP-13的基因表達(dá)有關(guān)。對(duì)于滑膜細(xì)胞，研究使用重組人IL-1β刺激，可使NGF基因表達(dá)顯著升高，而采用含藥血清干預(yù)能使NGF基因表達(dá)顯著下調(diào)，但對(duì)于軟骨細(xì)胞，無論用采取何種干預(yù)方式對(duì)NGF基因表達(dá)均無明顯調(diào)節(jié)作用。研究表明，膝關(guān)節(jié)滑膜中神經(jīng)分布更為密集，但關(guān)節(jié)軟骨無神經(jīng)支配，由于NGF分布可能與神經(jīng)分布有關(guān)，因此軟骨細(xì)胞NGF基因表達(dá)未發(fā)生顯著變化［16］。