過(guò)琴，方介群，周桓

（江南大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 無(wú)錫 214000）

0 引言

結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在我國(guó)發(fā)病率逐年增加[1]。研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[2]。漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1（plasmacytoma variant translocation gene 1,PVT1）已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，如胃癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌[3]，但具體作用機(jī)制尚不明確。本研究主要通過(guò)分析PVT1 上單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）在CRC 中的表達(dá)情況，以期為明確PVT1 在CRC 中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集江南大學(xué)附屬醫(yī)院在2019 年3 月至9 月手術(shù)治療的CRC 患者28 例，術(shù)前均未接受放療、化療等治療，所有病例中的組織經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)直腸癌。手術(shù)后立即進(jìn)行取材并儲(chǔ)存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)組為腫瘤組織，對(duì)照組為距離腫瘤組織邊緣至少8cm 以上的正常腸黏膜上皮組織。組織標(biāo)本均經(jīng)過(guò)患者家屬書(shū)面同意并取得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

提取組 織RNA 中Trizol（Ambion 公 司），組 織DNA 提取試劑盒（9765）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR036A）、TB green（RR820A）均購(gòu)自Takara 公司，所有引物均由華大基因合成。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀器為ABI 7500 型（美國(guó)ABI 公司）、Nanodrop 核酸定量分析儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）、PCR 基因擴(kuò)增儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.3 基因型測(cè)定、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)（real-time quantitative PCR）

從DNA 提取試劑盒中提取出DNA 后，進(jìn)行LncRNA PVT1 rs2114358 PCR 擴(kuò) 增，引物序 列如下：F（5’-3’）：GTTCACTAGCTTGCAAATAC/T；R（5’-3’）：TCTACGGATGCATCTCTCAG。PCR 擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s 共30個(gè)循環(huán)，72℃徹底延伸7min，1%瓊脂糖凝膠中跑膠，凝膠成像系統(tǒng)拍照，產(chǎn)物測(cè)序。

Trizol 法提取組織RNA 后，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒及TB green 試劑盒法進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)，引物序列如下：F(5’-3’)：GGAGATTAAAAAGATGCCCCTC；R（5’-3’）：GCGTTATTCCCCAGACCACTGA；內(nèi)參基因GAPDH 引物序列如 下：F（5’-3’）：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT；R（5’-3’）：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：37℃ 15min、85℃ 5s。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性2min，95℃變性5s、60℃退火34s 共40 個(gè)循環(huán)，最后增加溶解曲線(xiàn)。根據(jù)溶解曲線(xiàn)判斷PCR 擴(kuò)增的特異性，采用2-ΔΔCT 方法計(jì)算PVT1 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理研究數(shù)據(jù)，采用兩組樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05 作為判定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的依據(jù)。實(shí)驗(yàn)包含3 次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 基因型檢測(cè)

LncRNA PVT1 rs2114358 基因型擴(kuò)增凝膠電泳圖，見(jiàn)圖1；28 例CRC 組織中，CC 型占21.4%（6/28），CT 型占39.3%（11/28），TT 型占39.3%（11/28）。

圖1 DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.2 PVT1 SNP 在組織中的表達(dá)

在PVT1 rs2114358 的三個(gè)基因型（CC 型、CT 型、TT型）相較于配對(duì)的正常腸組織中，CT 型在腫瘤組織中高表達(dá)，最大的差異倍數(shù)為3.97 倍（*P＜0.05）；CC 型在腫瘤組織中低表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖2 PVT1 rs2114358 不同基因型在CRC 腫瘤組織中相較于正常組織中表達(dá)的差異倍數(shù)

3 討論

LncRNA 是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200bp，生物來(lái)源廣泛、結(jié)構(gòu)保守的RNA 分 子[4]。Zhu 等[5]測(cè) 序發(fā)現(xiàn)，膀胱癌中3324 個(gè)lncRNAs 差異表 達(dá)，2120 個(gè)lncRNAs 差異倍 數(shù)超過(guò)2 倍。Huang 等[6]發(fā)現(xiàn)，OECC 在CRC 組織中高表達(dá)，且與肝轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。BCYRN1、kcna3 在CRC 組織中高表達(dá)[7,8]，BANCR 在CRC 組織中低表達(dá)[9]。研究表明，lncRNA 可作為預(yù)測(cè)肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和卵巢癌的預(yù)后指標(biāo)[10]?；蜻z傳變異對(duì)基因的結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生較大影響，進(jìn)而影響生物學(xué)功能。SNP 是最常見(jiàn)的遺傳變異，由單個(gè)核苷酸的改變（包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入）引起的基因多態(tài)性[11]。Mao 等[12]在晚期CRC 患者中發(fā)現(xiàn)，rs744591 和rs745666 與卡培他濱化療療效相關(guān)；rs744591 位點(diǎn)為A/A 純合子時(shí)，化療效果顯著差于其他基因型；rs745666 為G/G 時(shí)，則化療效果顯著優(yōu)于其他基因型。PVT1 不同基因型在CRC 組織中表達(dá)量不同，可以豐富PVT1 在CRC 中的作用機(jī)制。但具體的藥物治療療效還有待進(jìn)一步的研究。