鐘方炎，鄧劍雄，賴軍明，沈若妍，林 紅，羅 輝

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，南昌 330006； 2.義烏市中心醫(yī)院放射治療中心，浙江義烏 322000； 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，杭州 310013)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是男性第六大最常被診斷的癌癥，女性第十大最常被診斷的癌癥，分別占所有腫瘤診斷的5%和3%[1]。RCC有多種組織學(xué)亞型，每種亞型都具有獨(dú)特的分子格局，其中最常見的為腎透明細(xì)胞癌(clear cell RCC，ccRCC)，其可占到所有病例的75%，轉(zhuǎn)移后的ccRCC患者預(yù)后較差，診斷后5年總體生存率(overall survival，OS)不到10%[2]。目前對于ccRCC患者的治療首選手術(shù)切除，其他治療包括雷帕霉素哺乳動物靶標(biāo)抑制劑，抗血管生成藥物(血管內(nèi)皮生長因子抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑)，免疫治療藥物(比如：細(xì)胞程序性死亡受體1/細(xì)胞程序性死亡配體1抑制劑)等[3-6]，雖然ccRCC的治療手段取得了一定的進(jìn)展，但ccRCC患者的OS并沒有顯著增加。故發(fā)現(xiàn)新的治療手段，探索新的藥物靶向治療位點(diǎn)以及發(fā)現(xiàn)可以判斷ccRCC預(yù)后的新標(biāo)志物仍舊是研究者們的工作重點(diǎn)。

GINS復(fù)合物由四種蛋白質(zhì)組成(Sld5-Psf1-Psf2-Psf3)，分別對應(yīng)GINS4、GINS1、GINS2、GINS3基因，GINS復(fù)合體是真核生物建立DNA復(fù)制叉和復(fù)制體發(fā)展的基礎(chǔ)，其為真核生物復(fù)制解旋酶的核心成分之一，在DNA復(fù)制開始時(shí)，GINS復(fù)合物啟動環(huán)狀結(jié)構(gòu)，調(diào)控多功能蛋白、生長因子信號、受體分子等，參與DNA復(fù)制和細(xì)胞周期進(jìn)展的啟動[7]。既往研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，GINS家族基因的異常表達(dá)能夠促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展并提示疾病的預(yù)后，比如GINS4可以通過激活Rac1和CDC42促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長和進(jìn)程，GINS1的高表達(dá)可能與激素受體陽性乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)。然而GINS家族基因在ccRCC中的作用并不清楚，故在本研究中，通過運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)，探索GINS家族基因在ccRCC中的表達(dá)、突變及臨床預(yù)后相關(guān)性，此外還分析了GINS突變的ccRCC患者中差異表達(dá)量最高的50個(gè)基因，并結(jié)合GINS家族基因進(jìn)行了功能和通路分析。

1 材料和方法

1.1 ONCOMINE數(shù)據(jù)庫分析

ONCOMINE一個(gè)用于DNA或RNA序列分析的綜合在線癌癥微陣列數(shù)據(jù)庫(www.oncomine.org)，旨在促進(jìn)從全基因表達(dá)分析的研究發(fā)展[10]。在此項(xiàng)研究中，采用t檢驗(yàn)比較轉(zhuǎn)錄表達(dá)的差異;設(shè)定檢索閾值分別為P:1E-4,FC:1.5,Gene Rank Top:10%;資料類型mRNA。將GINS家族基因分別在該數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行ccRCC組織和正常腎組織mRNA表達(dá)量對比。

1.2 UALCAN分析

UALCAN是一個(gè)用于分析癌癥組學(xué)數(shù)據(jù)全面的、用戶友好的、交互式的在線網(wǎng)站(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)，其數(shù)據(jù)來源主要基于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和MET500轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[11]。使用該網(wǎng)站對ccRCC患者的臨床病理學(xué)特征和不同GINS基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P的截?cái)嘀禐?.05。

1.3 Kaplan-Meier plotter分析

Kaplan-Meier plotter是主要基于基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus,GEO)(http://kmplot.com/analysis/)和TCGA的數(shù)據(jù)來源可對基因表達(dá)與多種癌癥數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析的網(wǎng)站[12]。使用該網(wǎng)站通過OS和無復(fù)發(fā)生存率(relapse free survival，RFS)來評估不同GINS基因的臨床預(yù)后價(jià)值。進(jìn)入pan-cancer界面中勾選ccRCC，通過將不同GINS基因的中位mRNA表達(dá)量將ccRCC患者分成高表達(dá)組和低表達(dá)組，通過單因素COX回歸分析來評估其預(yù)后價(jià)值。

1.4 Metascape、String數(shù)據(jù)庫分析及Cytoscape可視化處理

Metascape是一個(gè)集中了豐富的生物學(xué)信息，旨在提供全面的基因注釋和分析資源的數(shù)據(jù)庫(http://www.metascape.org/)[13]。String是一個(gè)主要用于收集、整合和評價(jià)蛋白質(zhì)間作用關(guān)系并建立網(wǎng)絡(luò)圖的數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)[14]。利用Metascape對含有GINS家族基因突變的改變組中差異表達(dá)最高的50個(gè)基因及GINS家族基因進(jìn)行基因本體論(gene oncology，GO)富集和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析。使用String(版本11.0)網(wǎng)站對上述基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互相作用(protein-protein interaction network，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖的勾畫，并將其在Cytoscape(版本3.7.2)軟件[15]中進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 GINS家族基因在泛癌和ccRCC中mRNA的表達(dá)

通過上述檢索條件在ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中檢測20種腫瘤組織中4個(gè)GINS家族基因的mRNA表達(dá)，并與正常組織進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)GINS1、2、3均在ccRCC中呈現(xiàn)高表達(dá)(圖1)。GINS1在腎癌中有2項(xiàng)數(shù)據(jù)集高表達(dá)(均為ccRCC)；GINS2在腎癌中有1項(xiàng)數(shù)據(jù)集高表達(dá)；GINS3在腎癌中有4項(xiàng)高表達(dá)(1項(xiàng)為ccRCC)；GINS4在腎癌中無數(shù)據(jù)集高表達(dá)。其中在Beroukhim Renal數(shù)據(jù)集中，GINS1分別在非遺傳性ccRCC組和遺傳性ccRCC組中與正常腎組織出現(xiàn)表達(dá)差異，差異倍數(shù)(fold change,FC)分別為2.354和2.467，t分別為7.117和6.393，P分別為8.91×10-8和1.62×10-7。GINS2在Beroukhim Renal數(shù)據(jù)集的非遺傳性ccRCC組中出現(xiàn)表達(dá)差異，F(xiàn)C為1.837，t為5.637，P為1.10×10-6。GINS3在Jones Renal數(shù)據(jù)集的ccRCC組中出現(xiàn)表達(dá)差異，F(xiàn)C為4.324，t為20.152，P為2.58×10-23(表1)。在UALCAN網(wǎng)站中，通過選擇樣本類型，可以觀察到GINS2/3/4在ccRCC組織比正常組織顯著高表達(dá)(P<0.001),GINS1在ccRCC組織比正常組織高表達(dá)(P<0.05)。

A:GINS家族基因在數(shù)據(jù)集中的表達(dá)；B—E:GINS家族基因在ccRCC組織與正常腎組織中的mRNA表達(dá)。*P<0.05，***P<0.001。

表1 ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中GINS1、GINS2、GINS3 mRNA的表達(dá)量差異

2.2 臨床病理學(xué)特征與不同GINS基因mRNA表達(dá)情況的相關(guān)性分析

在UALCAN網(wǎng)站對GINS家族基因的mRNA表達(dá)量在ccRCC患者數(shù)據(jù)中分別選擇癌癥分期、腫瘤分級進(jìn)行分析(圖2)。在癌癥分期中GINS1/2/4 mRNA表達(dá)量在4期中最高，GINS3的mRNA表達(dá)量在2期中最高，其中GINS2的4期表達(dá)量與其他分期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在腫瘤分級中GINS3/4在1級中表達(dá)最高，GINS1在3級中表達(dá)最高，其中GINS2基因在4級中表達(dá)最高，并且與其他分級比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：GINS家族基因表達(dá)與ccRCC癌癥分期之間的關(guān)系；B:GINS家族基因表達(dá)與ccRCC腫瘤分級之間的相關(guān)性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 GINS家族基因表達(dá)與ccRCC患者生存預(yù)后的關(guān)系

將GINS家族基因在Kaplan-Meier plotter中與ccRCC患者進(jìn)行OS和RFS分析(圖3)。在OS曲線圖中，GINS2高表達(dá)組相比于低表達(dá)組顯示出較低的OS(HR=1.71,CI1.27～2.30;P=0.000 38)，其余差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在RFS曲線圖中，GINS家族基因差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A:不同GINS基因的高表達(dá)組和低表達(dá)組分別與總體生存率之間的關(guān)系；B:不同GINS基因的高表達(dá)組和低表達(dá)組分別與無復(fù)發(fā)生存率之間的關(guān)系。

2.4 GINS家族基因與改變組中差異表達(dá)基因的通路、功能富集及PPI網(wǎng)絡(luò)圖

對相關(guān)基因進(jìn)行GO富集及KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在細(xì)胞周期過程的調(diào)控、DNA復(fù)制涉及的DNA鏈延長、紡錘體微管與著絲點(diǎn)連接的調(diào)節(jié)、DNA構(gòu)象變化、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、減數(shù)分裂細(xì)胞周期的調(diào)控、p53類介質(zhì)對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控等方面起作用(圖4A)。并將這些基因在string網(wǎng)站中進(jìn)行繪制，去除了不相連的節(jié)點(diǎn)后構(gòu)建了一個(gè)具有40個(gè)節(jié)點(diǎn)和293條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖4B)。

含有GINS家族基因突變的改變組中差異表達(dá)最高的前50個(gè)基因及GINS家族基因的通路和功能富集(A)以及其PPI網(wǎng)絡(luò)圖(B)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，GINS家族基因mRNA在ccRCC中均有高表達(dá)，且4個(gè)家族基因與癌癥分期和腫瘤分級均有相關(guān)性，其中GINS2基因的mRNA表達(dá)隨著癌癥分期和腫瘤分級上升有著增加的趨勢，并分別在4期和4級中達(dá)到最高。在生存分析中發(fā)現(xiàn)GINS2在ccRCC患者中的OS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其GINS2高表達(dá)組相比低表達(dá)組有著較低的OS。對有GINS家族基因突變的改變組中最高差異表達(dá)的50個(gè)基因及GINS家族基因進(jìn)行聯(lián)合分析，其中在細(xì)胞周期過程的調(diào)控、DNA復(fù)制涉及的DNA鏈延長及有絲分裂細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變中富集最為顯著，這提示ccRCC的發(fā)生發(fā)展可能與細(xì)胞周期中相關(guān)基因有關(guān)。

GINS2基因作為GINS家族基因之一，參與多種細(xì)胞信號通路，與一系列其他受體和生長因子共同調(diào)控細(xì)胞周期和增殖[18]，并在DNA復(fù)制的起始階段，介導(dǎo)Cdc45和微小染色體維持蛋白之間的互相作用[19]，而且其與DNA損傷存在聯(lián)系[20]。GINS2基因在許多實(shí)體腫瘤中大量表達(dá)，與癌細(xì)胞的生長、增值、侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，并通過參與細(xì)胞周期的調(diào)控影響多種生物學(xué)特征。YAN等[21]研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常卵巢組織，GINS2的表達(dá)在上皮性卵巢癌組織中更高(16.7% vs 58.3%)，且通過GINS2基因下調(diào)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增值和生存能力，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，因此GINS2可能參與了上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。YE等[22]研究顯示，GINS2通過TGF-β1來調(diào)節(jié)CITED2和LOXL2，從而促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和減少其凋亡。此外，在乳腺癌和非小細(xì)胞癌中GINS2也通過相關(guān)機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和減少凋亡[23-24]，在該研究中GINS2基因的mRNA表達(dá)量隨著癌癥分期和腫瘤等級的上升呈現(xiàn)增加的趨勢，且在不同分期和等級之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異，這可能也印證著高表達(dá)的GINS2在ccRCC中也具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、生長和減少凋亡的能力。OUYANG等[25]發(fā)現(xiàn)，與正常宮頸組織相比，宮頸癌腫瘤細(xì)胞系和腫瘤標(biāo)本中GINS2明顯上調(diào)，GINS2的表達(dá)與鱗狀細(xì)胞癌抗原(P<0.001)，深層基質(zhì)浸潤(P=0.021)，生命狀態(tài)(P<0.001)，復(fù)發(fā)(P<0.001)和盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)存在顯著相關(guān)性，且與GINS2低表達(dá)患者相比，GINS2高表達(dá)的患者的OS更低。結(jié)合本研究的結(jié)果GINS2的mRNA高表達(dá)提示較低的OS(P=0.000 38)，這或許可以假設(shè)，由于GINS2的高表達(dá)促進(jìn)了ccRCC的腫瘤細(xì)胞增殖并減少凋亡，從而促進(jìn)了疾病的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)并降低了患者的生存率?？傊?，本研究提示GINS2基因可以作為ccRCC的預(yù)后標(biāo)志物。

本研究的局限性：僅利用生物信息學(xué)技術(shù)，通過在線數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)將GINS家族基因在ccRCC患者中的表達(dá)、臨床特征信息和預(yù)后情況進(jìn)行分析，接下來希望有更多的臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究來進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。