任順成，胡海洋

河南工業(yè)大學(xué) 河南省天然色素制備重點實驗室，河南 鄭州 450001

在臘腸、火腿等肉制品生產(chǎn)過程中，會添加一定量的亞硝酸鹽和硝酸鹽。亞硝酸鹽在酸性條件下分解生成的亞硝基可以與肉制品中肌紅蛋白或血紅蛋白反應(yīng)，生成亮紅色的亞硝基肌紅蛋白或亞硝基血紅蛋白，因而使肉制品呈現(xiàn)粉紅色，賦予肉制品誘人的色澤，即發(fā)色作用[1-2]。另外，亞硝酸鹽還能抑制肉毒梭狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌的生長繁殖，起到抑菌防腐的作用[3-5]；同時，亞硝酸鹽可以抑制油脂氧化，能夠作為抗氧化劑應(yīng)用于食品中，保障了產(chǎn)品的質(zhì)量[6]。亞硝酸鹽的適量攝入對人體心血管系統(tǒng)還頗有好處，因為亞硝酸鹽本身是一種血管擴張劑，能夠在人體內(nèi)暢通血管、改善血流，并且?guī)椭梭w控制血壓[7]。正是基于亞硝酸鹽擁有這些無法取代的作用，一些生產(chǎn)者往往不按照標準使用，過量攝入致使食物中毒衛(wèi)生安全事件常有發(fā)生。

1 亞硝酸鹽和亞硝胺的危害

1.1 亞硝酸鹽

亞硝酸鹽廣泛存在于水域、植物及許多食物中，它可以在食品和人體中較容易地由硝酸鹽進行轉(zhuǎn)化。亞硝酸鹽的主要食物來源包括腌肉和谷類，而人類攝入的亞硝酸鹽中約有90%是由口腔中硝酸鹽的轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生，這主要是通過口腔中硝酸鹽還原酶的作用實現(xiàn)[8]。亞硝酸鹽能與血紅蛋白相互作用，通過Fe2+氧化成Fe3+形成高鐵血紅蛋白，從而阻止或降低血液輸送氧氣的能力，這種情況被描述為高鐵血紅蛋白癥，尤其是在嬰兒中(即藍嬰綜合征)頻繁出現(xiàn)[9-10]。在胃中，亞硝酸鹽和仲胺之間的反應(yīng)會導(dǎo)致亞硝胺的形成，而亞硝胺被認為是致癌、致畸和致突變的，增加了人體患胃癌和食道癌的風(fēng)險[11-13]。NaNO2作為N-亞硝胺的前體物質(zhì)具有很強的遺傳毒性和致癌性，被WHO列入2A類致癌物，一般人體攝入0.3～0.5 g亞硝酸鹽便可引起中毒，超過3 g則會致死[7]。其中硝酸鹽的每日可接受攝入量為人體重的3.7 mg/kg，亞硝酸鹽的每日可接受攝入量為人體重的0.06 mg/kg[14]。

1.2 亞硝胺

亞硝胺是一種具有很強毒性的化學(xué)物質(zhì)，可誘使有機體發(fā)生基因突變，具有致畸性和強致癌性，胃癌、食道癌等均與亞硝胺的攝入有一定關(guān)系。亞硝胺在機體內(nèi)的代謝主要是通過羥基化途徑進行的，經(jīng)過羥基化代謝之后，會生成強致癌物質(zhì)烷基重氮離子，它能使DNA、RNA及蛋白質(zhì)發(fā)生烷基化作用，引起機體各器官的癌變。研究表明亞硝酸鹽與生物胺(如尸胺、腐胺)和蛋白質(zhì)氧化降解的產(chǎn)物(如谷氨酸、丙氨酸)都可以產(chǎn)生亞硝胺[15]。其中仲胺與亞硝酸鹽發(fā)生亞硝化反應(yīng)的速度最快，但在有硫氫酸根存在的條件下(譬如人的唾液)，伯胺和叔胺與亞硝酸鹽的反應(yīng)也會加快，同時胃部的酸性環(huán)境對亞硝化反應(yīng)的進行非常有利，即使胃液中含有少量的亞硝酸鹽和胺類物質(zhì)，仍會有相對較多的二甲基亞硝胺(NDMA)生成[2]。目前亞硝胺的理論研究模型通常采用模擬胃液體系(pH 3.0，溫度37 ℃)，并加入二甲胺(DMA)、亞硝酸鹽等前體物質(zhì)和磷酸鹽緩沖液。如二甲胺與亞硝酸鹽在弱酸環(huán)境下可以形成NDMA，其主要生成途徑是兩分子HNO2生成活性中間體N2O3，再由DMA經(jīng)過亞硝化步驟生成NDMA。

2 影響亞硝化反應(yīng)的因素

在生產(chǎn)過程中，肉制品中亞硝酸鈉的添加量是其殘留量的決定性因素，國家標準規(guī)定肉制品中亞硝酸鈉殘留量不應(yīng)超過0.03 g/kg，但實際上在原材料里加入的亞硝酸鈉低于規(guī)定的最大使用量0.15 g/kg，肉制品中的亞硝酸鈉殘留量也會存在超標現(xiàn)象。影響亞硝酸鈉殘留量和亞硝胺生成的因素主要有原料肉的肥瘦比例、原料肉的新鮮程度、加工工藝、天然物質(zhì)的添加等。理論上亞硝化反應(yīng)最適pH 值為3.0～4.0，在pH值過低的情況下不能生成亞硝胺，過高則反應(yīng)速率變慢[15]。原料肉中的瘦肉占比較大時，能提供充足的乳酸和肌紅蛋白與亞硝基發(fā)生反應(yīng)，從而消耗更多的亞硝酸鹽，相應(yīng)地，亞硝酸鹽的殘留量與亞硝胺含量也就會降低[16]。肉制品生產(chǎn)工藝的不同，也可能導(dǎo)致亞硝酸鹽殘留量和亞硝胺含量增加，油炸、熏烤肉制品中亞硝胺含量更高，而微波加熱亞硝胺含量較少。同時腌制溫度高、時間短，殘留量就會相應(yīng)增加[17]。研究表明，食品中含有的維生素C、植物提取物、多酚等物質(zhì)也可以影響亞硝化反應(yīng)的進行。在健康志愿者飲用葡萄酒后，測量其胃內(nèi)排出的氣體中含有大量一氧化氮，證實了葡萄酒能夠促進一氧化氮的產(chǎn)生。維生素C和咖啡酸在亞硝酸鹽還原為一氧化氮的過程中起協(xié)同作用。從機理上來說，一氧化氮的形成與亞硝酸鹽的單價還原有關(guān)，亞硝酸鹽的還原主要取決于酚的結(jié)構(gòu)，并且在這一過程中形成了酚的硝基衍生物[8]。

3 亞硝化反應(yīng)的控制措施

隨著食品行業(yè)的快速發(fā)展，政府和人民對食品安全也更加關(guān)心。提高食品的質(zhì)量與安全問題迫在眉睫。

3.1 添加天然提取物

目前，大多選擇添加天然物質(zhì)來干擾亞硝化反應(yīng)。桐花樹[18]、姜[19]、桔梗[20]、橘核[21]、蘋果[22]等植物提取物對亞硝酸鹽均具有良好的清除作用。Vivar-Vera等[23]在豬肉、火雞肉的混合物中添加了楊桃膳食纖維濃縮物，使維也納香腸的抗氧化能力上升、亞硝酸鹽含量大幅度降低。劉星[24]研究了山楂和洋蔥提取物對亞硝酸鹽清除率的影響，對比黃芪等14種天然植物清除亞硝酸鹽的效果，結(jié)果表明山楂和洋蔥提取物的亞硝酸鹽清除率較高，分別達到94.25%、84.50%，清除效果較好。

3.2 利用生物方法

利用生物方法可降解亞硝酸鹽從而減少亞硝胺的生成[25-27]。He等[28]研究了低溫好氧反硝化菌黃山假單胞菌J488，在15 ℃時能夠有效去除廢水中的多種氮源，對氨氮、硝酸鹽和亞硝酸鹽的去除率分別為100%、92.61%和92.49%。He等[29]則發(fā)現(xiàn)了一種低溫好氧假單胞菌菌株Y-11對硝酸鹽和亞硝酸鹽表現(xiàn)出較高的去除能力，當菌株Y-11在15 ℃條件下培養(yǎng)4 d，初始氨氮質(zhì)量濃度為209.62、204.61、204.33 mg/L (pH 7.2)時，硝酸鹽和亞硝酸鹽的去除率分別為93.5%和81.9%，相應(yīng)的去除速率分別達到1.99、1.74 mg·L-1·h-1。但利用生物方法的研究還不夠完善，有待進一步發(fā)展。

3.3 使用多酚及其復(fù)配

多酚是植物的次生代謝產(chǎn)物，作為安全的天然產(chǎn)物，多酚普遍存在于植物組織中，是人類膳食的重要組成部分。同時多酚作為抗氧化劑、抗誘變劑、自由基清除劑等受到研究人員和食品制造商的廣泛關(guān)注。在泡菜、肉制品中加入一定量的多酚可以有效阻斷亞硝胺的生成，并且能夠直接消減亞硝酸鹽，具有良好的線性清除關(guān)系。多酚類物質(zhì)在消化過程中可能與其他物質(zhì)競爭亞硝化反應(yīng)，并進一步阻止胃中亞硝胺的生成[30]。

研究表明，紅酒中含有的槲皮素、兒茶素等多酚可將亞硝酸根離子還原為NO，有效清除了口腔和胃中的亞硝酸鹽[31-32]。大豆酚類物質(zhì)可能通過加速亞硝酸鹽的減少，干擾酸性環(huán)境中NO的代謝，其亞硝酸鹽還原活性與酚類物質(zhì)含量呈正相關(guān)[33]。添加硒酵母和茶多酚的基礎(chǔ)日糧可以有效提高武昌團頭魴的抗亞硝酸鹽能力，同時兩者的聯(lián)合使用也比單獨添加硒酵母或茶多酚更有效[34]。Li等[35]研究了綠茶、葡萄籽多酚和抗壞血酸對干腌香腸成熟過程中的pH值、水分活度、微生物數(shù)量、硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)、亞硝酸鹽和亞硝胺殘留量的影響，TBARS和亞硝胺含量在香腸成熟過程中呈上升趨勢，但隨著植物多酚和抗壞血酸的添加而顯著減少。植物多酚和抗壞血酸能顯著降低亞硝酸鹽的殘留量，其中抗壞血酸效果最好。結(jié)果表明，植物多酚和抗壞血酸能有效地保持干腌香腸的質(zhì)量和安全性。在模擬胃液條件下，Veljovic-Jovanovic等[36]研究了(+)-兒茶素和槲皮素與亞硝酸反應(yīng)的相互作用。亞硝酸與(+)-兒茶素反應(yīng)產(chǎn)生的一氧化氮可進一步轉(zhuǎn)化為6，8-二硝基兒茶素，槲皮素則部分抑制二硝基兒茶素的形成。此外，6，8-二硝基兒茶素可被亞硝酸氧化為醌類自由基，而槲皮素能明顯抑制醌的形成。兒茶素和原花青素的氧化會導(dǎo)致亞硝基化合物的形成，綠原酸的氧化也會導(dǎo)致硫氰酸鹽共軛的形成，綠原酸、兒茶素、原花青素的氧化速率依次增大，其中二硝基化合物的產(chǎn)生被認為是由于在兒茶素和原花青素的自由基中加入了一氧化氮[37]。研究表明，原花青素、表兒茶素沒食子酸酯的高亞硝酸鹽還原活性可能是因為以下因素：容易產(chǎn)生半醌、存在酚類偶聯(lián)、酸性pH值容易引起分子共振的變化[33, 38]。其中，原花青素和兒茶素基于B環(huán)中的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)、C環(huán)中的3位羥基，以及具有最大清除自由基活性的5-OH和7-OH的存在，對亞硝酸鹽的清除起到了重要作用[39]。

3.4 其他方法

添加化學(xué)合成物質(zhì)或者一些能起到類似亞硝酸鹽發(fā)色或防腐作用的物質(zhì)也可以減少其殘留量。研究表明，山梨酸鹽、次磷酸鹽、紅曲色素、氨基酸和肽等物質(zhì)與亞硝酸鹽共同作用，可以降低亞硝酸鹽添加量，進一步減少亞硝胺的生成量[40-42]。

4 亞硝化反應(yīng)的檢測方法

檢測亞硝化反應(yīng)的方法較多，目前研究成熟的技術(shù)主要為光譜法和色譜法兩大類。根據(jù)要求與條件可以選擇不同的方法，在檢測條件允許的情況下，可以使用氣相色譜法或高效液相色譜法。如果是追求快速檢測，可以使用光譜法中的分光光度法。

4.1 光譜法

光譜法中常見的檢測方法為紫外分光光度法，該方法的原理是在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色物質(zhì)，在540 nm波長下測定吸光度。而亞硝胺的測定則是利用亞硝胺的光化學(xué)反應(yīng)，在紫外光照射下，分解為亞硝酸根離子，經(jīng)重氮化后，與α-萘胺偶合生成紅色化合物，測定其吸光度。Masic等[43]首次研制了一種浸沒式原位紫外傳感器，建立了紫外吸收光譜與尿亞硝酸鹽濃度之間的關(guān)系。進一步分析表明，硝化尿液中懸浮物對亞硝酸鹽測定的影響較小，由于尿亞硝酸鹽濃度過高而導(dǎo)致的飽和度嚴重影響模型的性能，這表明稀釋是一個必不可少的樣品準備步驟。Ozdestan等[14]利用分光光度法對土耳其愛琴海地區(qū)10種綠葉蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量進行檢測。首次對野蘿卜、菊苣、茴香、福薊、藍錦葵和甜菜進行了分析，被測蔬菜的亞硝酸鹽含量小于26.33 mg/kg，回收率達到95.7%。同時利用高效液相色譜法對所建立的分光光度法進行了驗證，兩種方法對蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的測定結(jié)果相同。分光光度法測定亞硝酸鹽具有方法簡便、快速、成本低等優(yōu)點。

4.2 色譜法

色譜法檢測亞硝化反應(yīng)的常用方法為高效液相色譜法(HPLC)[44-47]、氣相色譜法(GC)[48-50]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[51]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[52-53]等。楊寧等[54]使用HPLC-MS檢測腌菜中9種N-亞硝胺，回收率達75.7%～116.0%，檢出限為0.20～0.49 mg/L。GC-MS用在亞硝胺檢測中亦具有較高的準確率及靈敏度，其在檢測限度內(nèi)，靈敏度可達到10-9水平，Yurchenko等[55]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定了386個肉制品中的5種揮發(fā)性亞硝胺。國外研究人員通過使用2個不同檢測器的高效液相色譜法對亞硝酸根離子進行檢測，在沒有去蛋白的情況下，使用0.02 mol/L高氯酸鈉水合物作為洗脫劑溶液，分析人血漿中的陰離子。在pH 3.9下，有機物質(zhì)不會影響分析[56]。Lu等[57]采用分散液-液微萃取和高效液相色譜-熒光檢測技術(shù)測定了5種亞硝胺(亞硝基吡咯烷、亞硝基二甲胺、亞硝基二乙胺、亞硝基二苯胺和亞硝基二乙胺)，該方法成功地應(yīng)用于6個樣品(泡菜、腌制香腸、熟醬油牛肉、啤酒、咸蛋和油炸鯖魚)中，在0.01～0.07 μg/g范圍內(nèi)具有較低的檢出限。色譜法檢測結(jié)果準確、靈敏度高，但是價格昂貴，得不到普遍的應(yīng)用。

4.3 其他方法

5 總結(jié)與展望

對目前研究亞硝化反應(yīng)的幾種主要的影響因素、控制措施和檢測方法分別進行了論述。關(guān)于影響亞硝酸鹽殘留量和亞硝胺生成因素的研究較為完善，但亞硝化反應(yīng)的控制措施和檢測方法還有待發(fā)展。其中，檢測方法多采用紫外分光光度法、液相色譜法和氣相色譜法，適合實驗室使用，但是現(xiàn)場快速檢測技術(shù)還有待進一步發(fā)展。在食品生產(chǎn)過程中，各個研究機構(gòu)多從蔬菜、水果等植物中提取抗氧化成分進行研究，對于不同食源多酚及其協(xié)同作用和相應(yīng)的反應(yīng)機理，學(xué)術(shù)界的研究還有待加強，應(yīng)用到肉制品加工中也較為少見，應(yīng)引起重視。膳食多酚是復(fù)雜的天然化合物，對人體具有公認的健康益處。研究不同類型的多酚對亞硝化反應(yīng)的影響，并對多酚與亞硝化反應(yīng)的機理進行探討，這可以為維持和提高食品安全提供更多的理論基礎(chǔ)，也是拓寬多酚類功能食品的開發(fā)與生產(chǎn)的必要過程。