王 敏，張明丹，彭丹丹，劉亞楠，黃繼紅，劉 娜

河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001

胚芽是玉米生長和發(fā)育的開端，質(zhì)量僅占玉米的11%～14%，約含有20%粗蛋白，必需氨基酸含量高，生物效價達到64%～72%[1-3]。玉米胚芽可作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源，在生產(chǎn)加工方面有廣泛應用，宋春麗等[4]發(fā)現(xiàn)添加玉米胚芽蛋白的香腸出品率、質(zhì)構(gòu)、咀嚼度增加，黏著性減?。魂憰詾I等[5]將At3942蛋白酶酶解玉米胚蛋白的酶解液添加到醬油中，醬油的色澤、體態(tài)、香氣、滋味有明顯提高；徐玉娟等[6]研發(fā)的玉米胚蛋白乳飲料營養(yǎng)豐富，感官評分可達到93.25，穩(wěn)定性達96.92%。

近幾年隨著人們對營養(yǎng)需求的不斷增加，植物蛋白飲料備受青睞，它們的生產(chǎn)開發(fā)是今后飲料工業(yè)發(fā)展的趨向[7-8]。作者以玉米胚芽粕為原料，生產(chǎn)一款玉米胚芽植物蛋白飲料基料。玉米胚芽粕雖營養(yǎng)豐富，但口感粗糙且柔韌性差，通過酶解可解決這一問題[9]。酶解過程可降低植物蛋白飲料基料的黏度，有效改善口感，同時提高玉米胚芽肽的含量，促進人體對蛋白的吸收[10-11]。玉米胚芽粕是玉米胚芽榨油后的主要副產(chǎn)品，研發(fā)玉米胚芽植物蛋白飲料基料，可以促使玉米胚資源全方位利用，并有效提升玉米胚蛋白利用的價值鏈。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

玉米胚芽：河南飛天農(nóng)業(yè)開發(fā)股份有限公司；木瓜蛋白酶(10萬U/g)、堿性蛋白酶(20萬U/g)、酸性蛋白酶(5萬U/g)、中性蛋白酶(5萬U/g)：河南萬邦實業(yè)有限公司；三氯乙酸：上海吉至生化科技有限公司；膽汁提取物：潤慧生物有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、沒食子酸、蘆丁、α-淀粉酶、DPPH：北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

TGL-16 M型高速離心機：鑫貝西科學儀器有限公司；臺式OLB-100C恒溫搖床：山東博科科學儀器有限公司；SPARK多功能酶標儀：瑞士TECAN；JY6002型電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的準備

玉米胚芽經(jīng)CO2超臨界萃取后，過100目篩(蛋白質(zhì)含量18.5%)，置于密封袋中干燥處儲藏備用。

1.3.2 蛋白酶的篩選

在料液比1∶ 12(g/g)的物料中分別添加0.3%的木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶，并在最適溫度的條件下水解3 h，以多肽含量、水解度和酶解液顏色為指標，挑選出試驗的最適酶。

1.3.3 多肽含量的測定

參考文獻[12-13]的方法，略有改動。分別取4 mL樣品和4 mL 10%的三氯乙酸混合并靜置10 min，離心，取全部上清液于25 mL 容量瓶中，用5%的TCA定容，取3.0 mL樣液于10 mL離心管中，并添加雙縮脲試劑2.0 mL，混勻靜置，離心后于540 nm處測定吸光度。

1.3.4 單因素試驗

參考文獻[14]的酶解條件，略有改動。探究酶解時間(0、1、2、3、4、5、6 h)、酶的添加量(0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%)、料液比(1∶ 10、1∶ 12、1∶ 14、1∶ 16、1∶ 18、1∶ 20)和酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)對酶解液多肽含量的影響，確定玉米胚芽植物蛋白飲料基料工藝的最佳條件。

1.3.5 響應面試驗

根據(jù) Box-Behnken 設計原理，在單因素試驗的基礎上進行響應面試驗。

1.3.6 感官評價

對酶解玉米胚芽植物蛋白飲料基料的顏色(顏色深淺度、色澤是否均勻一致)、組織狀態(tài)(質(zhì)地是否均勻、是否有沉淀及雜質(zhì)產(chǎn)生)和口感(是否產(chǎn)生異味、是否有顆粒感)進行評測。

1.3.7 體外模擬消化過程

1.3.7.1 模擬口腔消化

參考文獻[15]的方法，略有改動。模擬唾液：準確稱取 2.38 g 磷酸氫二鈉、0.19 g 磷酸二氫鉀、8.00 g 氯化鈉和 0.91 g α-淀粉酶溶于1 L純水，用磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)pH 6.75。

口腔消化過程：取4 mL玉米胚芽飲料基料和16 mL模擬唾液，充分混勻后，放入37 ℃搖床中振蕩15 min。滅酶后置于離心機，12 000 r/min離心15 min，取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7.2 模擬胃液消化

參考文獻[16-17]的方法，略有改動。模擬胃液：取2.0 g 氯化鈉和3.2 g胃蛋白酶溶于950 mL純水中，使用6 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值為1.2后定容為1 L。

胃消化過程：取口腔消化液10 mL，用6 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1.2后加入50 mL模擬胃液。充分搖勻后置于37 ℃搖床中消化2 h，每隔30 min取出一定量的懸濁液，水浴滅酶、冷卻。離心取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7.3 模擬腸液消化

參考文獻[16-17]的方法，略有改動。模擬腸液：準確稱取0.143 g胰蛋白酶和0.857 g膽汁提取物溶于100 mL 0.1 mol/L 的碳酸氫鈉緩沖溶液中。

腸消化過程：取腸消化液10 mL，用0.1 mol/L碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)樣液的pH值至6.0后，加入60 mL的模擬腸液。再分別加入2.5 mL 1 mol/L的NaCl和2.5 mL 1 mol/L的KCl。置于37 ℃搖床中消化180 min，每隔30 min取出一定量的懸濁液滅酶、冷卻。離心取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.8 功能活性成分的測定

1.3.8.1 總酚含量的測定

參考文獻[18]的方法，略有改動。取0.2 mL消化液與1 mL福林酚試劑混勻，反應5 min 后加3 mL 7.5 % Na2CO3溶液混勻，遮光放置1 h后，于765 nm處測定吸光度，計算多酚含量，進行3次試驗取平均值?？偠喾雍客ㄟ^沒食子酸標準曲線定量。

1.3.8.2 總黃酮含量的測定

參考文獻[18]的方法，略有改動。將1.0 mL消化液、2.5 mL純水、150 μL 5%NaNO2溶液充分混合。室溫下反應5 min后加入300 mL 10%Al(NO3)3，6 min后加入2 mL 4%NaOH溶液充分混勻，靜置。在510 nm處測定吸光度?？傸S酮含量通過蘆丁標準曲線定量。

1.3.9 抗氧化能力的測定

參考文獻[19-20]的方法，略有改動。取1 mg DPPH溶于24 mL甲醇溶液中，超聲溶解，避光保存。同時將消化液配制成1 mg/mL。取1 mL DPPH溶液與0.5 mL稀釋后的消化液混勻，在517 nm處測定吸光度。

式中:A0為1 mL DPPH+0.5 mL甲醇溶液的吸光度;A為1 mL DPPH+0.5 mL稀釋后的樣品溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組試驗設計3次平行，使用SAS 9.2軟件對數(shù)據(jù)進行分析，Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

由表1可知，木瓜蛋白酶酶解玉米胚芽，多肽含量相對較高，水解度最高，且對酶解液顏色影響最小，綜合考慮選擇木瓜蛋白酶為最適酶。

表1 蛋白酶的篩選Table 1 Screening of protease

2.2 單因素試驗

多肽含量與酶解時間的關(guān)系如圖1a所示。在溫度50 ℃、初始pH 6、酶添加量0.6%、料液比1∶ 14的條件下，酶解時間為5 h時，多肽含量達到最高59.89 mg/mL，較酶解前(11.52 mg/mL)提高了48.37 mg/mL。當繼續(xù)延長酶解時間到6 h時，多肽含量顯著下降，原因可能是隨著酶解時間的延長，底物含量會逐漸減少，酶促反應不會增加；同時活性肽被過度水解為無活性的肽和氨基酸[20]。

多肽含量與料液比的關(guān)系如圖1b所示。在溫度50 ℃、初始pH 6、酶添加量0.6%、酶解時間6 h的條件下，多肽含量隨水分的增加而減少。料液比從1∶ 10變?yōu)?∶ 12時，多肽含量顯著下降，料液比為1∶ 14時，多肽含量變化不顯著。因為酶的比例下降，部分蛋白質(zhì)的酶解反應可能不夠徹底。從經(jīng)濟角度和玉米胚芽植物蛋白飲料的濃度考慮，選擇料液比為1∶ 14。

多肽含量與酶添加量的關(guān)系如圖1c所示。在溫度50 ℃、初始pH 6、酶解時間6 h、料液比1∶ 14的條件下，隨著木瓜蛋白酶添加量的增大，多肽含量也顯著增加，當接種量為0.6%時，多肽含量達到最大值55.17 mg/mL，較原液提高了43.65 mg/mL。因為在一定條件內(nèi)，酶添加量與酶促反應成正比，隨著酶添加量的增加，酶解反應增加，且蛋白酶可以將不溶于水的蛋白水解成小分子肽[21]。當酶接種量繼續(xù)增加時，多肽含量顯著下降，原因可能是酶的添加量于底物濃度相對較高時，酶解反應的速度由底物濃度決定，同時酶能將原本具有活性的肽水解成沒有活性的肽[22]。說明繼續(xù)加大酶添加量不能使酶促進程加快，從經(jīng)濟角度衡量，選擇酶添加量為0.6%。

多肽含量與酶解溫度的關(guān)系如圖1d所示。在料液比1∶ 14、初始pH 6、酶添加量0.6%、酶解時間6 h的條件下，當酶解溫度小于50 ℃時，隨著溫度的升高，多肽含量顯著增加(P<0.05)。表明在一定溫度范圍內(nèi)，酶解溫度與酶促反應成正比。溫度較低時，酶活性較低，抑制了底物與酶的反應[23]。當酶解溫度為50 ℃時，多肽含量達到最大值54.11 mg/mL。酶解溫度繼續(xù)升高，多肽含量顯著減小，說明溫度過高會使酶失活，降低了酶促反應。因此，木瓜蛋白酶酶解的最佳溫度為50 ℃。

注：a、b、c、d分別為酶解時間、料液比、酶添加量、酶解溫度對多肽含量的影響,不同的小寫字母表示差異性顯著(P<0.05)。圖1 單因素試驗結(jié)果Fig.1 Single factor test results

2.3 響應面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進行響應面試驗設計，結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設計與結(jié)果Table 2 Response surface design results

進行回歸分析，獲得擬合方程：Y=57.85-0.12X1+0.86X2+0.18X3-0.19X1X2+1.15X1X3+0.72X2X3-7.42X12-5.58X22-5.22X32。

由表3可知，模型的P<0.01，說明模型極顯著；且失擬項P>0.05，R2=0.995 0，表明模型擬合效果好，誤差小，可用于酶解制備玉米胚芽工藝條件的預測。3個因素中X2對玉米胚多肽含量的影響極顯著，X1和X3沒有顯著性，影響順序為X2>X3>X1，且X1和X3之間的交互作用極顯著。由響應面得出的最優(yōu)因素組合是酶解時間5.54 h、酶添加量0.62%、溫度50.11 ℃。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.4 驗證試驗

優(yōu)化得到的最優(yōu)因素組合是酶解時間5.54 h，酶添加量0.62%，酶解溫度50.11 ℃，此時多肽含量為55.72 mg/mL。綜合實際情況，將條件修訂為酶解時間5.5 h，酶添加量0.62%，酶解溫度50 ℃。為了驗證模型的準確性，在此條件下進行3次平行試驗，得到多肽含量為57.92 mg/mL，與理論值55.72 mg/mL的相對誤差為3.95%(小于5%)，所以響應面優(yōu)化得到的條件參數(shù)準確，具有可靠價值。

2.5 感官評價

由表4可知，經(jīng)酶解的玉米胚芽植物蛋白飲料基料色澤、質(zhì)地均勻一致，呈乳白色，且酶解后口感細膩，有醇香。

表4 酶解玉米胚芽植物蛋白飲料基料感官評價Table 4 Sensory evaluation of enzymatically hydrolyzed corn germ plant protein beverage base

2.6 功能活性成分

注：不同的大寫字母表示未酶解和酶解樣品有差異性，不同的小寫字母表示同類樣品差異性顯著(P<0.05)；N代表未消化，K代表口腔，W代表胃，C代表腸道，字母后的數(shù)字表示消化時間。圖3、圖4同。圖2 體外模擬胃腸消化過程中玉米胚芽飲料基料中總酚含量的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic change of total polyphenolic content in corn germ beverage base during in vitro simulated gastrointestinal digestion

由圖2可知，酶解飲料基料從口腔(155.76 mg/L)經(jīng)模擬胃液30 min(40.16 mg/L)消化后，酚類物質(zhì)含量顯著下降。原因可能是酶解后的玉米胚芽中的酚類物質(zhì)主要以游離態(tài)存在，在過酸消化環(huán)境中由于缺乏固體底物保護,多酚物質(zhì)更易于分解和轉(zhuǎn)化，部分不穩(wěn)定的多酚物質(zhì)被氧化分解[23]。酶解飲料基料在腸道消化階段(74.43 mg/L)顯著高于胃消化階段(38.84 mg/L)。有研究表明胃消化中的胰蛋白酶能促使羧基斷裂從而使多酚失去束縛被釋放出來[24]。同時在未消化和經(jīng)胃腸道消化后，酶解飲料基料的總酚含量均顯著高于未酶解飲料基料的總酚含量，分別為3.19倍和1.96倍。這與李興[25]研究復配飲料體外消化多酚含量變化一致。

由圖3可知，酶解飲料基料從口腔(220 mg/L)經(jīng)模擬胃液30 min(89.44 mg/L)消化后總黃酮含量顯著下降。原因可能是在腸道消化中總黃酮含量與腸道中的環(huán)境有關(guān)，首先，黃酮物質(zhì)可能與腸道消化道中某些成分(如鹽、酶等)結(jié)合形成一些不溶性物質(zhì)。其次，胃腸道中的溫度和pH值也會影響黃酮的結(jié)構(gòu)。酶解飲料基料在腸道消化階段(146 mg/L)顯著高于胃消化階段(87.56 mg/L)?？赡苁俏赶褐械囊让改茚尫劈S酮與淀粉、蛋白質(zhì)等大分子結(jié)合形成復合物[24]。同時在未消化和經(jīng)胃腸道消化后，酶解飲料基料的總黃酮含量均顯著高于未酶解飲料基料的總黃酮含量，分別為1.88倍和1.76倍。這與Gawlik-dziki等[26]研究添加蕎麥小麥面包和未添加蕎麥小麥面包體外消化總黃酮含量變化一致。

圖3 體外模擬胃腸道消化過程中玉米胚芽飲料基料中總黃酮含量的動態(tài)變化Fig.3 Dynamic change of total flavonoids content in corn germ beverage base during in vitro simulated gastrointestinal digestion

2.7 體外消化抗氧化性

由圖4可知，酶解飲料基料從口腔(73.58%)經(jīng)模擬胃液30 min(37.11%)消化后DPPH自由基清除率顯著下降。一方面酶解液中的抗自由基活性物質(zhì)被氧化和分解，從而失去活性；另一方面胃液環(huán)境的變化可能影響抗自由基活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、從而影響其與DPPH間的相互作用[23]。酶解飲料基料在腸道消化階段(56.64%)顯著高于胃消化階段(41.56%)?？赡苁窃谀c道消化過程中DPPH自由基與暴露出的疏水性氨基酸側(cè)鏈結(jié)合[27]。同時在未消化和經(jīng)胃腸道消化后，酶解飲料基料的DPPH自由基清除率均顯著高于未酶解飲料基料的DPPH自由基清除率，分別為2.11和2.05倍。這與劉燕[23]研究雙菌發(fā)酵燕麥和未發(fā)酵燕麥DPPH自由基清除率變化一致。

圖4 體外模擬胃腸道消化過程中玉米胚芽飲料基料DPPH自由基清除率的動態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of DPPH radical scavenging rate of corn germ beverage base during in vitro simulated gastrointestinal digestion

3 結(jié)論

通過響應面試驗優(yōu)化玉米胚芽植物蛋白飲料基料的工藝條件，得到最佳工藝：料液比1∶ 14、酶解時間5.5 h、酶添加量0.62%、酶解溫度50 ℃，此時多肽含量為57.92 mg/mL。經(jīng)酶解后，玉米胚芽植物蛋白飲料基料口感風味更佳，營養(yǎng)豐富。以玉米胚芽植物蛋白飲料基料為原料，模擬體外消化實驗，發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃腸消化后總酚、總黃酮含量和DPPH自由基清除率均顯著下降，但均顯著高于未酶解玉米胚芽植物蛋白飲料基料，分別為1.96、1.76、2.05倍，表明經(jīng)酶解后抗氧化性增強。通過玉米胚芽植物蛋白飲料基料的研發(fā)可以增加玉米的附加值，提高玉米的綜合利用率。