何天富，陳曉藝，羅宇東，陳洪濤，劉源煥，譚安薔，龐曉云

（廣西中醫(yī)藥大學制藥廠，南寧 530023）

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是危害中、老年人健康的常見、多發(fā)病。VD 的發(fā)病機制目前尚不明確，國內外尚無有效控制VD 病程進展的方法[1]。而VD 是中國第二大癡呆癥患者群，約有950萬中風患者會出現(xiàn)繼發(fā)的認知障礙。隨著人口老齡化社會的到來，控制血管危險因素對于預防認知障礙至關重要。

復方扶芳藤合劑（Fufangteng compound，F(xiàn)FTC）為《中國藥典》（2015年版）收錄品種，該藥品是由扶芳藤、紅參、黃芪等中藥經提取加工而成的復方制劑，具有益氣補血、健脾養(yǎng)心的功效[2]。臨床上，F(xiàn)FTC對血栓預測陽性轉陰、認識功能及腦血循環(huán)障礙和腦萎縮等均有較好的療效，有助于老年VD 的防治[3]。有研究報道，F(xiàn)FTC 能明顯延長凝血時間，降低血液黏度，有抗心肌缺氧、抗衰老、抗應激及改善微循環(huán)等作用[4-7]，但關于FFTC治療VD的實驗研究報道不多。本研究通過建立多發(fā)腦梗死性癡呆大鼠模型模擬VD，并給予不同劑量FFTC 進行干預，探討FFTC 對多發(fā)腦梗死性癡呆大鼠學習、記憶能力及血液黏度的影響和作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級SD 大鼠，雌雄各半，體重180～220 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK2014-0002，飼養(yǎng)于溫度22～25 ℃、相對濕度55%～70%的SPF級動物房內，自由攝食、飲水。本研究已取得廣西中醫(yī)藥研究院動物實驗倫理委員會批準，審批號：2017100902。

1.2 藥物、主要儀器與試劑 FFTC（批號：20170403），褐色稠膏，每克膏相當于6.71 g生藥，由廣西中醫(yī)藥大學制藥廠提供。吡拉西坦片（腦復康）（批號：20170301，宜昌人福藥業(yè)）。Morris 水迷宮（北京眾實迪創(chuàng)發(fā)展有限責任公司）；全波長全自動多功能酶標儀（美國賽默飛）；TDL-5-A 離心機（上海安亭科學儀器廠）。乙酰膽堿酯酶（AchE）測試盒、考馬斯亮蘭蛋白測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測試盒、一氧化氮（NO）測試盒、內皮素-1（ET-1）測試盒、凝血酶時間(TT)測試盒、凝血酶原時間(PT)測試盒、活化部分凝血活酶時間（APTT）測試盒、纖維蛋白原（FIB）測試盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.3 動物分組及給藥 所有大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后隨機分為7 組，每組10 只，即空白對照組、假手術組、模型組、陽性藥腦復康（0.432 g/kg）組及FFTC低劑量（3.8 g/kg）組、中劑量（7.5 g/kg）組、高劑量（15.0 g/kg）組（低、中、高劑量相當于人臨床日用劑量的5倍、10倍、20倍，臨用前用蒸餾水配制成所需濃度）。各給藥組大鼠按10 mL/kg灌胃給予相應藥物，空白對照組、假手術組和模型組大鼠給予等量蒸餾水。連續(xù)灌胃3 d 后造模，之后再連續(xù)灌胃12 d，共給藥15 d，1次/d。

1.4 多發(fā)腦梗死性癡呆大鼠模型的建立[8]于大鼠左心室采血，血液置于37 ℃干燥箱內烘干8 h，研碎后過200 μm篩得到血栓栓子，用時取血栓栓子1 mg加生理鹽水0.3 mL，搖勻成混懸液。10%水合氯醛按0.35 g/kg體重腹腔注射麻醉大鼠，頸正中切開皮膚，剝離胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌與胸鎖乳突肌，暴露頸總動脈、頸外動脈與頸內動脈，暫時夾閉頸總動脈，于頸外動脈逆行注入栓子鹽水混懸液0.3 mL，推注同時開放頸總動脈，使栓子通過頸內動脈進入顱內至大腦各動脈，造成多發(fā)性腦梗死，然后結扎頸外動脈，縫合皮膚。造模后，根據(jù)大鼠神經行為學評分篩選合格模型。假手術組手術方法同模型組，在穿刺時給予0.3 mL生理鹽水代替血栓栓子混懸液?？瞻讓φ战M不予處理。

1.5 血液流變學及凝血功能檢測 實驗后抽取大鼠腹主動脈血，檢測各組血液流變學指標（高、中、低切全血黏度和血漿黏度）、凝血四項指標（TT、PT、APTT、FIB）水平。

1.6 Morris水迷宮試驗（包括定位航行實驗和空間探索實驗）觀察大鼠學習、記憶能力（1）第1 天定位航行試驗：試驗開始先將大鼠放入水池中（不放平臺）自由游泳2 min，使其熟悉迷宮環(huán)境。試驗共歷時5 d，每天定于固定時間段，每個時間段訓練2 次。訓練開始時，將平臺置于第三象限，從池壁4個起始點的任一點將大鼠面向池壁放入水池。記錄系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺的時間（逃避潛伏期）和游泳路徑，2次訓練即將大鼠分別從4個不同的起始點（不同象限）放入水中。大鼠找到平臺后或120 s內找不到平臺（潛伏期記為120 s），則將大鼠引導到平臺，在平臺上休息15 s，再進行下一次試驗。每日以大鼠2次訓練潛伏期的平均值作為大鼠當日的學習成績。（2）第2天空間探索實驗：第6天撤除平臺，將大鼠從第二象限入水，所有大鼠必須為同一入水點，記錄大鼠第三象限停留時間、首次穿臺時間和2 min內穿臺次數(shù)。

1.7 血漿SOD、MDA、NO、ET-1水平測定 行為學測試完畢后，大鼠眼眶取血，肝素鈉抗凝，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，按試劑盒說明書分別測定血漿中SOD、MDA、NO、ET-1水平。

1.8 腦組織SOD、MDA、AChE 水平測定 處死各組大鼠，迅速取腦稱重，用生理鹽水制成10%腦組織勻漿液，低溫離心，取上清液，按試劑盒說明書分別測定腦組織中SOD、MDA、AChE水平。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 7組大鼠不同時間尋找平臺的潛伏期和路徑比較 空白對照組與假手術組大鼠尋找平臺的潛伏期和路徑比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；第1 天，7 組尋找平臺的潛伏期和路徑比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；第2至第5天，模型組大鼠尋找平臺的潛伏期和路徑長于假手術組（P＜0.05），腦復康組和FFTC高劑量組尋找平臺的潛伏期和路徑短于模型組（P＜0.05），而FFTC中、低劑量組與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1、表2。

表1 7組大鼠不同時間尋找平臺的潛伏期比較s，

表1 7組大鼠不同時間尋找平臺的潛伏期比較s，

與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與FFTC低劑量組比較，&P＜0.05。

表2 7組大鼠不同時間尋找平臺的路徑比較cm，

表2 7組大鼠不同時間尋找平臺的路徑比較cm，

與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.2 7組大鼠空間探索能力比較 空白對照組與假手術組在第3 象限停留時間、首次穿臺時間、2 min內穿臺次數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；與假手術組比較，模型組在第三象限停留時間明顯縮短，首次穿臺時間延長，2 min內穿臺次數(shù)減少（均P＜0.05）；腦復康組、FFTC 高、中劑量組在第3 象限停留時間長于模型組，首次穿臺時間短于模型組，2 min內穿臺次數(shù)多于模型組（均P＜0.05），而FFTC 低劑量組與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表3。

表3 7組大鼠空間探索能力比較

表3 7組大鼠空間探索能力比較

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.3 7組大鼠SOD、MDA、AchE水平比較 空白對照組與假手術組大鼠腦組織SOD、MDA、AchE水平及血漿SOD、MDA水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；與假手術組比較，模型組大鼠血漿、腦組織SOD水平及腦組織AchE水平降低，血漿、腦組織MDA 水平升高（均P＜0.05）；與模型組比較，腦復康組、FFTC高劑量組大鼠血漿、腦組織SOD水平及腦組織AchE 水平升高，血漿、腦組織MDA 水平降低（P＜0.05）；FFTC中、低劑量組大鼠與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表4。

表4 7組大鼠SOD、MDA、AchE水平比較

表4 7組大鼠SOD、MDA、AchE水平比較

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.4 7 組大鼠血液流變學指標比較 空白對照組與假手術組大鼠高、中、低切全血黏度、血漿黏度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；模型組大鼠高切、中切、低切全血黏度和血漿黏度高于假手術組（P＜0.01）；腦復康組、FFTC高劑量組大鼠高切、中切、低切全血黏度和血漿黏度低于模型對照組（P＜0.05）；FFTC中、低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表5。

表5 7組大鼠血液流變學指標比較

表5 7組大鼠血液流變學指標比較

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.5 7組大鼠凝血四項指標比較 空白對照組與假手術組大鼠凝血四項指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；模型組大鼠TT、PT、APTT時間短于假手術組，F(xiàn)IB 水平高于假手術組（P＜0.05）；腦復康組、FFTC 高劑量組TT、PT、APTT 時間長于模型對照組，F(xiàn)IB 水平低于模型組（P＜0.05）；FFTC 中、低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表6。

表6 7組大鼠凝血四項指標比較

表6 7組大鼠凝血四項指標比較

與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

2.6 大鼠血漿NO、ET-1 含量比較 空白對照組與假手術組大鼠血漿NO、ET-1含量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；模型組大鼠血漿NO、ET-1 水平高于假手術組（P＜0.01）；腦復康組、FFTC高劑量組大鼠血漿NO、ET-1 水平低于模型組（P＜0.05）；FFTC 中、低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表7。

表7 7組大鼠血漿NO、ET-1含量比較

表7 7組大鼠血漿NO、ET-1含量比較

與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

3 討論

癡呆癥是65歲以上老年人致殘的主要原因，中國癡呆癥患者例數(shù)約占全世界癡呆癥患者總數(shù)的25%，隨著癡呆癥的發(fā)病率不斷上升，相關藥物開發(fā)進展緩慢的嚴峻形勢，給有關部門及研發(fā)人員帶來巨大的挑戰(zhàn)[9]。目前，癡呆癥治療的一線藥物包括膽堿酯酶抑制劑，如多奈哌齊和卡巴拉汀，以及NMDA 受體拮抗劑美金剛。本研究FFTC（又名百年樂）由紅參、扶芳藤、黃芪組成。FFTC 中各味藥材均有相關報道可改善VD。FFTC 能夠有效改善D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁（ALCl3）所致癡呆小鼠學習記憶能力[10]。扶芳藤提取物對大鼠急性腦缺血再灌注損傷具有保護作用，能夠有效抑制腦組織中白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平[11]，下調缺血腦組織中c-fos表達[12]，降低腦組織與血清中白細胞介素-6T(IL-6T)、TNF-α的表達水平[13]。

VD 的發(fā)病機制尚不明確，目前學者研究認為與基因突變、自由基損傷、神經細胞凋亡、神經遞質紊亂、自由基損傷、β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積和tau蛋白異常磷酸化等有關。其中，炎癥損傷是VD 一個重要的病理學特征，腦缺血后的炎癥反應TNF-α、IL-1β、NO 等炎癥介質的上調，外周白細胞富集，激活膠質細胞，從而導致免疫細胞釋放有毒介質，破壞血腦屏障，相反地，血腦屏障的破壞引起繼發(fā)性缺血性腦損傷[14]。氧化應激也是加重VD的重要影響因素，MDA 是細胞膜質過氧化損傷產生的代謝終產物，可間接反應細胞膜質過氧化程度，而SOD是機體內一種非常重要的抗氧化酶，可清除機體內過多的氧自由基[15]，在臨床應用上血清中MDA 在VD 中的表達升高、SOD 表達降低，均為VD 發(fā)病的參考依據(jù)[16]。臨床上，膽堿酯酶抑制劑可抑制乙酰膽堿的分解，改善輕度至中度VD患者的認知功能，有學者推測膽堿能缺陷或乙酰膽堿介導的神經傳遞減少可能在VD 中發(fā)揮作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FTC 能夠增加多發(fā)腦梗死性癡呆大鼠血漿和腦組織中SOD 水平、降低MDA 水平，并增加腦組織中AchE 水平（P＜0.05），推測FFTC 可對抗自由基損傷，減少脂質過氧化反應，提高腦組織膽堿能神經活力。

本研究通過Morris 水迷宮試驗和空間探索試驗探討FFTC對癡呆大鼠學習、記憶能力的影響，結果顯示：FFTC 能夠縮短多發(fā)腦梗死性癡呆大鼠定位航行潛伏期，縮短定位巡航路徑（P＜0.05），初步驗證了FFTC能提高學習、記憶的認知功效。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FTC 可有效降低多發(fā)腦梗死性癡呆大鼠高切、中切、低切全血黏度和血漿黏度（P＜0.05），改善多發(fā)腦梗死性癡呆模型大鼠血液流變性異常；凝血四項指標檢測結果提示FFTC 明顯延長多發(fā)腦梗死性癡呆模型大鼠TT、PT、APTT，降低FIB 水平（P＜0.05），表明FFTC 對多發(fā)腦梗死性癡呆模型大鼠有抗凝血作用。FFTC還可降低多發(fā)腦梗死性癡呆模型大鼠血漿NO、ET-1水平，說明其具有抑制NO過量釋放引起的神經毒性作用及擴放血管的作用。

綜上所述，F(xiàn)FTC 能改善多發(fā)腦梗死性癡呆大鼠的學習、記憶功能，對多發(fā)腦梗死性癡呆大鼠具有降低血液黏度，有效調節(jié)凝血系統(tǒng)的作用，可用于臨床上治療VD。其作用機制可能與對抗自由基損傷、減少脂質過氧化反應、提高腦組織膽堿能神經活力、改善血液流變性異常、抗凝血、抑制NO 過量釋放引起的神經毒性及開放血管等作用有關。