麻日亮，王曉夏，凌茂瑤，廖曉婷，李俊達，潘靈輝

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，南寧 530021）

機械通氣（mechanical ventilation，MV）是高級生命支持的重要組成部分，其目的是使呼吸機得到休息，同時為機體提供足夠的氣體交換[1]。然而，呼吸機應(yīng)用不當可以加重原有的肺損傷，導(dǎo)致呼吸機相關(guān)性肺損傷（ventilator induce lung injury，VILI）[2]。MV 可以觸發(fā)炎性介質(zhì)的釋放，促進炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大而加重肺損傷[3]。髓樣細胞觸發(fā)受體（TREM）1/TREM2 作為TREMs 免疫球蛋白超家族的成員，廣泛分布于巨噬細胞、樹突狀細胞和小膠質(zhì)細胞中[4]，處在動態(tài)平衡過程中[5]，在創(chuàng)傷及炎癥反應(yīng)中起重要作用[6-7]。研究表明，TREM1的激活能夠促進促炎因子的分泌，加重組織損傷[8]。反之，TREM2 上調(diào)則能夠增強巨噬細胞的吞噬作用及全身炎癥抵抗作用[9]。然而，TREM1/TREM2 平衡在VILI中的作用機制尚未明確。因此，本研究通過建立VILI 小鼠模型，探討TREM1/TREM2 平衡在VILI中的表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30 只SPF 級健康雄性C57BL/6 小鼠，8周齡，體重（25±2）g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號為SCXK桂2020-0003。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學(xué)標準。

1.2 實驗分組 將30只小鼠隨機分為自主呼吸組（CON組，n=6）、正常潮氣量組（NVT組，VT=10 mL/kg，n=6）、大潮氣量組（HVT 組，VT=40 mL/kg，n=18），HVT 組再按照通氣時間不同分為3 個亞組：HVT 1組（通氣時間1 h）、HVT 2組（通氣時間2 h）、HVT 3組（通氣時間4 h），每組6只。

1.3 VILI 模型建立 參照文獻[10-11]方法制備VILI模型。小鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg 麻醉后連接EZ-SAR-1000 小動物呼吸機（美國）進行MV。呼吸機參數(shù)設(shè)置：按實驗分組設(shè)定呼吸機潮氣量，吸入氧濃度（FiO2）為21%，吸呼比（I∶E）為 1∶1，通氣頻率80 次/min，呼氣末正壓（PEEP）為0 cmH2O。間斷腹腔注射1%戊巴比妥鈉20 mg/kg維持麻醉。

1.4 肺組織濕/干（W/D）重比值檢測 取右肺上葉組織，稱濕重（W），放置于65 ℃烘干箱48 h 后稱取干重（D），計算W/D比值。

1.5 肺組織病理學(xué)觀察 取右肺下葉置于4%多聚甲醛過夜，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，石蠟切片（5 μm），行蘇木精—伊紅（HE）染色。光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，拍照。根據(jù)肺泡腔或肺泡間質(zhì)炎性細胞浸潤和肺泡壁厚度進行病理學(xué)評分[12]，評分越高，損傷越嚴重。

1.6 肺泡灌洗液（BALF）中炎性因子含量檢測 按照酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢愛博泰克生物科技有限公司）說明書步驟操作，測定BALF中白細胞介素（IL）-1β、IL-6的水平。

1.7 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測肺組織TREM1、TREM2 mRNA 表達 采用TRIzol 提取肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照PCR試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，RR047A）操作步驟在PCR儀（Thermo Fisher Scientific，Otower）上進行PCR 擴增，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，61 ℃退火、延伸30 s，共40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物均由上海生工生物工程合成，序列如下：TREM1 上游：5’-ATGTGTTCACTCCTGTCATCAT-3’，下游：5’-GAGAAGTCCACAGATGACTGAA-3’；TREM2 上游：5’-CTGGAACCGTCACCATCACTC-3’，下游：5’-CGAAACTCGATGACTCCTCGG-3’；β-actin 上游：5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’，下游：5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。

1.8 Western blotting 法檢測TREM1、TREM2 蛋白表達 取20 mg肺組織，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF，冰上裂解，離心，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，蛋白定量后加入蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min 使蛋白變性。取60 μg 蛋白進行SDSPAGE，200 mA 轉(zhuǎn)膜60 min，TBST 洗滌，5%脫脂牛奶封閉90 min，加入兔抗小鼠TREM1、TREM2和βactin 抗體（北京博奧森生物科技有限公司，稀釋比均為1∶500），4 ℃冰箱孵育過夜，TBST洗滌；加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗（武漢愛博泰克生物科技有限公司，AS014，稀釋比1∶10 000），室溫下孵育1 h，TBST 洗滌3 次。采用電化學(xué)發(fā)光（ECL）法顯影，Image Lab 測量條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin 蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5 組肺組織W/D 比值及病理學(xué)評分比較 與CON組相比，HVT 2組和HVT 3組肺組織W/D比值和病理學(xué)評分均明顯升高（均P＜0.05）；HVT 2組與HVT 3 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），CON組、NVT 組和HVT 1 組比較，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 5組小鼠肺組織W/D比值和病理學(xué)評分比較

表1 5組小鼠肺組織W/D比值和病理學(xué)評分比較

與CON組比較，aP＜0.005；與NVT組比較，bP＜0.05。

顯微鏡下可見CON組與NVT組肺泡結(jié)構(gòu)大致正常。隨著通氣時間延長，HVT 組可見肺泡壁斷裂，肺泡融合，肺間質(zhì)增厚及大量炎性細胞浸潤，甚至肺泡腔內(nèi)有紅細胞滲出，見圖1。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變（HE染色，×200）

2.2 5組BALF中總蛋白、IL-1β、IL-6含量比較 與CON組相比，HVT 2組和HVT 3組BALF中總蛋白、IL1-β、IL-6 水平均顯著升高（均P＜0.05）；HVT 3 組BALF 中總蛋白含量顯著高于HVT 1 組，IL-1β、IL-6 含量顯著高于HVT 1 組和HVT 2 組（均P＜0.05）；CON 組、NVT 組和HVT 1 組BALF 中總蛋白、IL-1β、IL-6 含量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 5組BALF中總蛋白、IL-1β、IL-6含量比較

表2 5組BALF中總蛋白、IL-1β、IL-6含量比較

與CON 組比較，aP＜0.05；與NVT 組比較，bP＜0.05；與HVT 1組比較，cP＜0.05；與HVT 2組比較，dP＜0.05。

2.3 5 組肺組織TREM1、TREM2 mRNA 和蛋白表達比較 隨通氣時間延長，肺組織TREM1 表達逐漸增高，TREM2 表達逐漸降低。與CON 組相比，HVT 1 組、HVT 2 組 和HVT 3 組肺組織TREM1 mRNA 和蛋白表達顯著增高，TREM2 mRNA 和蛋白表達顯著降低，TREM1/TREM2 比值顯著高于CON 組和NVT 組（均P＜0.05），CON 組與NVT 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。HVT 3 組TREM1 mRNA表達顯著高于HVT 1組和HVT 2組（P＜0.05），HVT 1 組和HVT 2 組TREM1 mRNA 表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；HVT 1 組、HVT 2 組、HVT 3 組TREM2 mRNA 表達兩兩比較均有明顯差異（P＜0.05）。HVT 3組TREM1蛋白表達顯著高于HVT 1 組（P＜0.05），而HVT 3 組TREM2 蛋白表達顯著低于HVT 1 組（P＜0.05），HVT 1組與HVT 2組、HVT 2組與HVT 3組TREM1和TREM2 蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表3。

表3 5組小鼠肺組織TREM1/TREM2 mRNA和蛋白表達比較

表3 5組小鼠肺組織TREM1/TREM2 mRNA和蛋白表達比較

與CON組比較，aP＜0.05；與NVT組比較，bP＜0.05；與HVT 1組比較，cP＜0.05；與HVT 2組比較，dP＜0.05。

圖2 肺組織TREM1、TREM2蛋白電泳圖

2.4 相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)分析顯示，TREM1與TREM2 mRNA 和蛋白表達均呈負相關(guān)關(guān)系（r=-0.952，P＜0.001；r=-0.683，P=0.03）。

3 討論

VILI的致病機制復(fù)雜，目前認為其發(fā)病機制是MV導(dǎo)致肺泡過度擴張、過高肺內(nèi)外壓力差、肺泡周期性打開的物理性損傷和損傷部位釋放炎癥介質(zhì)導(dǎo)致臨近正常部位或遠處器官的炎癥性損傷[13]。本研究通過構(gòu)建VILI小鼠模型，發(fā)現(xiàn)隨著通氣時間延長，肺組織損傷加重，表現(xiàn)為肺組織W/D 值顯著增加，肺HE 染色顯示肺泡壁斷裂，肺泡融合，肺間質(zhì)增厚及大量炎性細胞浸潤，甚至肺泡腔內(nèi)有紅細胞滲出，病理學(xué)評分升高，同時BALF 中總蛋白、IL-1β、IL-6含量顯著升高（均P＜0.05），表明VILI模型構(gòu)建成功。

TREMs 是一類在先天免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的細胞表面受體家族，與多種生物學(xué)功能有關(guān)，包括炎癥和免疫、凝血、骨代謝、細胞分化、神經(jīng)可塑性和神經(jīng)發(fā)育[14]。在TREMs家族成員中，TREM1 被視為炎癥反應(yīng)的放大劑，激活的TREM1 通過與TLR 通路協(xié)同，觸發(fā)并放大炎癥反應(yīng)，促進趨化因子和細胞因子的產(chǎn)生[15]。TREM1激動劑促進了HVT造成的炎癥反應(yīng)和肺損傷，而使用TREM1抑制劑則緩解了HVT造成的炎癥反應(yīng)和肺損傷[16]。TREM2 作為髓樣細胞上表達的模式識別受體新成員，越來越多的證據(jù)證明，其在癌癥、神經(jīng)退行性變及炎癥疾病過程中起負調(diào)節(jié)作用[17-18]。研究表明，TREM2 基因敲除小鼠經(jīng)LPS 處理后，肺組織中出現(xiàn)更為嚴重的急性肺損傷，上調(diào)TREM2 的表達可緩解LPS所致的急性肺損傷[19]。

正常情況下，機體內(nèi)高表達TREM2 而低表達TREM1，相關(guān)因素處理后改變TREM1和TREM2的平衡，進而導(dǎo)致相應(yīng)疾病，調(diào)整兩者平衡，可在一定程度上改善疾病嚴重程度[20]。經(jīng)高脂、土霉素飲食處理的小鼠肝臟標本中TREM1的表達隨脂肪肝的嚴重程度而增高，而TREM2 的表達隨脂肪肝的嚴重程度而下降，兩者表達呈負相關(guān)關(guān)系。給予甘氨酸處理后，TREM2的表達增高，而TREM1的表達減低，小鼠肝硬化程度減輕[21]。本研究采用qPCR 法和Western blotting 法檢測TREM1 和TREM2 的基因、蛋白表達，結(jié)果顯示，隨著MV 時間延長，HVT組TREM1 mRNA和蛋白表達升高，BALF中炎性因子IL-1β、IL-6 分泌明顯增加，而TREM2 的mRNA和蛋白表達降低，TREM1/TREM2比值增加（均P＜0.05），表明TREM1 表達上調(diào)與炎癥反應(yīng)及肺組織的損傷嚴重程度相關(guān)。TREM1 和TREM2 在VILI中可能互為拮抗。

綜上所述，在VILI 小鼠中促炎因子TREM1 與抗炎因子TREM2 的比值顯著上調(diào)，肺組織炎癥因子分泌增加，炎癥損傷加重；通過檢測TREM1/TREM2比值可以動態(tài)評價肺組織的炎癥變化。