鐘華戈，嚴(yán)林海，陳 伊，吳昌淘，唐衛(wèi)中

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科，南寧 530021）

結(jié)直腸癌是男性第三大、女性第二大常見癌癥，且致死率排在所有癌癥的第三位，近年來結(jié)直腸癌在我國的發(fā)病率也呈明顯上升趨勢[1]。研究表明，早期結(jié)直腸癌患者經(jīng)過治療可以獲得滿意生存，但是大部分患者就診時病變已經(jīng)處于進(jìn)展期甚至晚期，錯過了最佳治療時間，再者因原發(fā)腫瘤無法切除，化療藥物耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)等因素，從而導(dǎo)致晚期結(jié)直腸癌預(yù)后不佳[2-4]。結(jié)合目前早期篩查可有效遏制結(jié)直腸癌高發(fā)，因此，尋找一種早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的方法顯得十分有必要。

結(jié)直腸癌的形成是個復(fù)雜且多樣的過程，成因包括體細(xì)胞分子突變、飲食、環(huán)境、微生物和宿主免疫等。隨著對人類微生物研究的越來越深入，人類微生物組參與機(jī)體代謝，疾病的發(fā)展已被證實[5]。在人體內(nèi)，結(jié)直腸中的腸道菌群是維持腸道微生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要組成成分，主要通過直接或間接參與了免疫調(diào)節(jié)、物質(zhì)代謝和消化吸收等過程，從而保護(hù)腸黏膜、維持腸道穩(wěn)態(tài)和機(jī)體正常功能以及抵抗疾病等[6]。Zouggar 等[7]研究表明，腸道菌群隨著宿主的生活和飲食習(xí)慣進(jìn)行動態(tài)調(diào)節(jié)，與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)，當(dāng)其結(jié)構(gòu)和功能受到破壞時通過破壞腸黏膜上皮細(xì)胞、參與宿主機(jī)體代謝和產(chǎn)生致癌物質(zhì)等方式誘發(fā)結(jié)直腸息肉和癌變。此外，研究表明，腸道微生物群在“腺瘤－癌序列”的形成中起到了重要的作用[8]。結(jié)直腸腺瘤發(fā)展為腸癌往往需要較長時間，這為在篩查過程中發(fā)現(xiàn)癌前病變并予以治療提供了時間窗，從而防止其癌變并使患者獲得長期生存。因此，腸道道微生物群在結(jié)直腸癌的起始可能提供對腫瘤發(fā)生和早期預(yù)防潛在新方向。本研究通過微生物信息數(shù)據(jù)庫結(jié)合結(jié)直腸腺瘤患者宏基因組測序，觀察和驗證特征菌群變化，為通過腸道菌群作為生物標(biāo)志物篩查和治療干預(yù)直腸癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 選取廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的35 例結(jié)直腸腺瘤患者及35 例健康對照，均行腸鏡檢查，年齡40～69 歲，在廣西本地居住5 年以上，兩個月未服用抗生素、酸奶，并排除其他腸道疾病。于患者鏡檢2 個月后，取患者糞便樣本中段于無菌冰盒，分裝于2 mL EP管中，放置于-80 ℃冰箱中保存。結(jié)直腸腺瘤患者與健康對照一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已取得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 糞便樣本腸道菌群DNA提取 取200 mg糞便樣本，加入2 mL EX 緩沖液。取1.2 mL 糞便裂解物，70 ℃加熱5 min，1 500 r/min離心1 min，取200 μL上清液于含有1.5 mL 蛋白酶K 的微量離心管中；70 ℃下孵育10 min，加入200μL 75%乙醇，混勻；600 μL裂解物通過QIAamp離心柱，離心；向離心柱中加入500 μL Buffer AW2，1 500 r/min 離心1 min洗脫DNA。

1.3 糞便DNA宏基因組測序及文庫構(gòu)建 嚴(yán)格按照TruSeq Nano DNA Sample prep Kit（Illumina）說明書進(jìn)行全基因組測序和文庫構(gòu)建。NanoDrop 測定gDNA 濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢查gDNA 的完整性，樣本質(zhì)檢后，使用Covaris S220 Sonicator 將gDNA 打斷至300～400 bp，純化，產(chǎn)物末端經(jīng)過修補(bǔ)成平末端，用磁珠進(jìn)行片段篩選；在3’末端加A。此片段的兩端分別與通用的接頭相連接，其中一個接頭帶有特異性的barcode序列，用以區(qū)分樣本的來源。連接產(chǎn)物經(jīng)純化去除連接不完整的產(chǎn)物以及接頭自連產(chǎn)物，用與接頭序列互補(bǔ)的通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢，Qubit測定濃度，2100 Bioanalyzer測定片段長度，構(gòu)建gDNA 文庫，用Agilent 2100 Bioanalyzer 進(jìn)行文庫質(zhì)檢，并對腺瘤組及健康對照進(jìn)行菌群豐度的比較分析。

1.4 健康對照—腺瘤患者—腺癌患者菌群差異分析 人類腸道宏基因組數(shù)據(jù)庫GMrepo是常用于腸道微生物菌群研究的數(shù)據(jù)庫之一，是由研究人員閱讀海量文獻(xiàn)以特定的圖形語言描述眾多微生物菌群改變和相互關(guān)系。GMrepo微生物數(shù)據(jù)庫的信息包括253個微生物測序項目的58 903個人體腸道樣本，與92種人類表型相關(guān)。本研究選取數(shù)據(jù)庫中健康對照、腺瘤患者、腺癌患者各30例，通過Fisher精確檢驗方法對比3組微生物富集情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 本項目分別采用MetaPhlAn25與HUMAnN26 生信分析軟件進(jìn)行分析。MetaPhlAn2與HUMAnN2是由美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）發(fā)起的人類微生物組計劃（HMP）發(fā)布的宏基因組學(xué)官方分析軟件對菌群豐度的分析與功能注釋進(jìn)行分析。后期數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析則采用LEfSe7、STAMP8、QIIME9等國際公認(rèn)的宏基因組學(xué)分析軟件與R 包（heatmap，ggplot2）進(jìn)行分析。采用Wilcoxon 秩和檢驗、Spearman 相關(guān)性、Fisher 精確檢驗方法等方法來評價腸道菌群相關(guān)的差異分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GMrepo分析健康對照—腺瘤患者—腺癌患者菌群豐度改變 對健康對照、腸道腺瘤患者、結(jié)直腸癌患者的糞便菌群原始豐度進(jìn)行GMrepo分析發(fā)現(xiàn)，健康對照和腸道腺瘤患者之間有4 個菌屬豐度存在顯著差異。腸道腺瘤患者和結(jié)直腸癌患者之間有6個菌屬豐度存在顯著差異。健康對照和結(jié)直腸癌患者之間有8個菌屬豐度存在顯著差異。健康對照、腸道腺瘤患者、結(jié)直腸癌患者3 組間98 個菌屬中有3個菌屬存在顯著豐度差異（P＜0.05），其中包括瘤胃球菌科（包括瘤胃球菌科和糞桿菌屬）、雙歧桿菌科、梭菌科，見圖1。

圖1 健康對照、腸道腺瘤患者和結(jié)直腸癌患者微生物菌群豐度在菌種水平上的差異

進(jìn)一步對腺瘤和結(jié)直腸癌患者進(jìn)行具體菌群差異分析，發(fā)生腺瘤到結(jié)直腸癌過程中患者普拉梭菌和雙歧桿菌的相對豐度較低，而牙周梭桿菌的相對豐度較高。采用隨機(jī)森林法對兩組進(jìn)行最優(yōu)區(qū)分的重要物種進(jìn)行識別，其中最重要的菌種為普拉梭菌，其次是牙周梭桿菌和雙歧桿菌，見圖2。

圖2 腺瘤、結(jié)直腸癌患者菌群GMrepo差異分析

2.2 腸道微生物宏基因組學(xué)測序驗證腺瘤患者與健康對照菌群差異 腺瘤患者的菌群豐度與健康對照比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。MetaPhlAn、HUMAnN 分析發(fā)現(xiàn)，腺瘤患者與健康對照在細(xì)菌微生物菌門水平上也存在顯著的差異，對每個重要分類單元的LEfSe 分析后進(jìn)行LDA 評分。采用隨機(jī)森林法對兩組進(jìn)行最優(yōu)區(qū)分的重要物種進(jìn)行識別，發(fā)現(xiàn)兩組腸道菌群在門水平上，放線菌門有明顯差異（P=0.002）。

圖3 腺瘤患者與健康對照菌群豐度比較

2.3 腺瘤患者與健康對照腸道微生物在菌屬水平上的差異 健康對照和腺瘤患者腸道菌群中普拉梭菌、羅氏弧菌、雙歧桿菌、唾液鏈球菌有顯著差異（均P＜0.05），見圖4。

圖4 4種水平腺瘤患者與健康對照菌群豐度比較

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生因素包括體細(xì)胞基因突變，生活環(huán)境，飲食結(jié)構(gòu)，宿主免疫和腸道微生物組成等，只有25%的患者有顯著的家族遺傳傾向，6%患者的癌癥發(fā)生與致癌基因突變存在顯著的關(guān)系[9]。生活習(xí)慣對結(jié)直腸癌的發(fā)生有著重要的意義。但是，以飲食習(xí)慣為例，并不是每個有高脂、多肉和低纖維飲食習(xí)慣的人必然會發(fā)展為腸癌。有證據(jù)指出結(jié)直腸癌的產(chǎn)生是由于受飲食等因素的影響整體腸道菌群的組成逐漸變化與基因的突變導(dǎo)致抑癌基因沉默共同導(dǎo)致的[10]。

口腔、呼吸道、腸道、泌尿生殖道等都存在著不同種類和數(shù)量的穩(wěn)定共存微生物群，稱為定居菌群。在定居菌群中，數(shù)量最多及種類最豐富的是腸道微生物，人類結(jié)腸中有非常多樣化和復(fù)雜微生物菌群區(qū)包括估計有100萬億的細(xì)菌，與病毒、細(xì)菌和真菌一起超過1 000 種異構(gòu)物種(約400 萬個基因)。腸道微生物的細(xì)菌基因組集是人類基因組基因的150倍，隨著近幾年人類微生物研究的熱潮，人類微生物組參與機(jī)體代謝，疾病的發(fā)展已被證實，實驗研究表明微生物發(fā)酵產(chǎn)物（如丁酸鹽）和微生物活化植物化學(xué)物質(zhì)（例如聚—酚類）具有廣泛的抗腫瘤效果，能抵抗腫瘤發(fā)生信號通路如組蛋白脫乙酰酶抑制促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制增殖并阻滯腫瘤轉(zhuǎn)化腸道微生物可以通過許多方面影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[11-14]。

通過GMrepo 網(wǎng)絡(luò)分析和宏基因組學(xué)驗證，本研究發(fā)現(xiàn)，健康—腺瘤—腺癌3 組的腸道菌群豐度存在明顯差異。屬水平上健康對照組有3 種細(xì)菌（雙歧桿菌、鏈球菌、糞桿菌）明顯高于實驗組，而雙歧桿菌和糞桿菌均為益生菌，其中屬于放線菌門的雙歧桿菌參與了免疫系統(tǒng)的成熟，是已知最具代表性的人腸道益生菌[15]。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)普拉梭菌豐度降低，是發(fā)生在健康—腺瘤—腺癌全程中的事件，普拉梭菌屬于厚壁菌門梭菌科。約占腸道糞便細(xì)菌總數(shù)的5%，是柔嫩梭菌亞群的主要成員之一，普拉梭菌不僅在健康對照和腸道疾病患者腸道及糞便中分布存在明顯差異（P＜0.05），并在腸道疾病中起到了腸道黏膜屏障保護(hù)及炎癥抑制等重要作用。它也是結(jié)腸中最重要的產(chǎn)丁酸菌，這種共生細(xì)菌已被認(rèn)為是人類健康的生物指標(biāo)，一旦它的種群減少，會使得腺瘤患者有更大的可能性發(fā)展為腺癌[16]。普拉梭菌與8 種腸道炎性代謝產(chǎn)物有相關(guān)性，提示這種細(xì)菌在參與宿主多種代謝過程中有著很重要的作用，其改變導(dǎo)致的微生態(tài)失衡與機(jī)體炎癥相關(guān)，雖然目前暫無普拉梭菌制成微生態(tài)制劑而直接應(yīng)用于臨床，但有研究表明普拉梭菌及其上清具有抗炎效應(yīng)，可明顯改善腸道炎癥[17]。

因此可以推斷腸道菌群豐度顯著改變可能與腸道炎癥反應(yīng)和免疫紊亂相關(guān)，而較高的炎癥反應(yīng)與免疫紊亂使腺瘤患者相對健康對照來說有更大的可能發(fā)展為結(jié)直腸癌，其中普拉梭菌豐度降低，有可能是加速這一過程的重要影響因素。