王麗珍 ,羊才進(jìn) ,謝五菊 ,李 玲△

（海南西部中心醫(yī)院 1.兒科；2.呼吸內(nèi)科，儋州 571700）

關(guān)鍵字 支氣管肺發(fā)育不良；高氧；芳香烴受體；白介素33

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)為引起持續(xù)性呼吸窘迫的慢性肺部疾病，是早產(chǎn)兒（妊娠期＜37周）常見疾病之一[1]。由于子宮內(nèi)胎肺的成熟過程是處于低氧環(huán)境，因此暴露于過早的高氧環(huán)境中會導(dǎo)致嚴(yán)重的新生兒肺損傷，從而促進(jìn)BPD 的發(fā)生發(fā)展[2]。而高氧導(dǎo)致BPD 的分子機(jī)制仍不明確。研究表明，白介素（IL）-33在高氧環(huán)境下調(diào)控炎癥因子的分泌加速BPD 的發(fā)生發(fā)展[3]。芳香烴受體（the aryl hydrocarbon receptor，AhR）作為一類配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控一系列應(yīng)對環(huán)境刺激的分子反應(yīng)[4]。近年來，AhR 越來越多的被認(rèn)為是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞應(yīng)答環(huán)境改變的重要分子，同時(shí)也參與炎癥以及癌癥的病理過程[5]。研究表明，在高氧環(huán)境下，AhR 減輕新生鼠肺組織的損傷程度[5]，但AhR 調(diào)節(jié)高氧條件下新生鼠肺損傷過程的機(jī)制仍未被闡明。由于新生鼠肺組織結(jié)構(gòu)與妊娠26～28周的胎兒肺組織相似[6]，因此本研究利用高氧新生鼠肺損傷模型初步探究闡釋AhR 對新生兒高氧肺損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 小鼠肺上皮細(xì)胞系MLE-12購自上海ATCC 細(xì)胞庫；C57BL/6J 小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室；培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自美國Hibco 公司；6孔板和培養(yǎng)瓶購自美國Coring公司；RIPA和胎牛血清購自北京索萊寶試劑有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物試劑有限公司；AhR、IL-33、GAPDH 引物購自上海生工公司；PVDF 膜購自美國Millipore 公司；ECL 發(fā)光液購自美國Promega公司；Myc、AhR、和GAPDH抗體購自美國Cell Signaling公司;IL-33 ELISA kit、L-Kynurenine購自英國Abcam公司。

1.2 小鼠高氧肺損傷模型 出生＜24 h，野生型C57BL/6J 雄性小鼠共16 只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為高氧組和正常組,每組8 只，高氧組小鼠體重為（3.43±0.37）g,正常組小鼠體重為（3.64±0.44）g,兩組體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高氧組置于氧濃度≥80%高壓氧艙內(nèi)，正常組在室內(nèi)空氣中(RA;21%O2)，氧濃度儀持續(xù)檢測氧濃度。兩組小鼠分別由代母鼠喂養(yǎng)，每兩天交換代母鼠。分別在開始實(shí)驗(yàn)的第3、7天，取4只小鼠進(jìn)行檢測。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12培養(yǎng)于10%FBS。培養(yǎng)箱溫度為37 ℃，CO2濃度為5%，O2濃度為20%。為模擬高氧環(huán)境，將細(xì)胞置于O2濃度＞70%環(huán)境中24 h后收取。正常對照組不做特殊處理將MLE-12 細(xì)胞接種于六孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞。分為兩組，分別為si-AhR 組和si-NC組。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h 后，利用liposome2000 進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h 后更換為完全培養(yǎng)基，24 h 后收取細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.4 AhR激動實(shí)驗(yàn) 將小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12接種于6 孔板中，每孔2×105個(gè)，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組加入AhR 激動劑L-Kynurenine，對照組不做特殊處理，培養(yǎng)48 h后收取細(xì)胞和上清液。

1.5 qPCR檢測細(xì)胞和小鼠肺組織 加入Trizol后，利用氯仿、異丙醇和75%乙醇溶液提取RNA,分光光度儀測定RNA濃度，并利用試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（Invitrogen）。qPCR 反應(yīng)體系：95 ℃預(yù)變性10 min,（95 ℃5 s，60 ℃30 s,72 ℃30 s）40 個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)以內(nèi)參GAPDH為參照，根據(jù)2–ΔΔCt公式計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。AhR 上游引物為5’-CCCTTCCCGCAAGATGTTAT-3’,下游引物為5’-TCAGCAGGGGTGGACTTTAAT-3’；IL-33 上游引物為5’-ATTTCCCCGGCAAAGTTCAG-3’,下游引物為5’-AACGGAGTCTCATGCAGTAGA-3’。內(nèi)參GAPDH上游引物為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’,下游引物為5’-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3’。

1.6 Western blotting 檢測 利用BCA 試劑盒進(jìn)行濃度測定，加入裂解液后煮沸變性。蛋白上樣后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)后將PVDF 膜8%脫脂奶粉封閉1.5 h,TBST 洗3 次，一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。后的用TBST 洗3 次，二抗孵育2 h 后ECL曝光內(nèi)參GAPDH（1∶2 000）和目的蛋白條帶。

1.7 ELISA檢測 將肺組織勻漿后取上清液，依照說明書使用IL-33 ELISA試劑盒（Abcam)測定IL-33的表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高氧下AhR在肺組織的表達(dá)

通過qRT-PCR 測定AhR 在高氧組和正常組新生鼠肺組織的表達(dá)水平，利用Western blotting 測定AhR 在高氧組和正常組的蛋白表達(dá)含量。第3 天，高氧組Ah R蛋白相對表達(dá)量為（0.87±0.08），顯著高于正常組（0.11±0.03）（t=25.1595,P＜0.001）；第7 天，高氧組AhR的相對表達(dá)量為（0.93±0.11），顯著高于正常組的（0.57±0.10）（t=6.849,P＜0.001），見圖1A。qPCR 結(jié)果顯示，第3 天高氧組AhR 的表達(dá)量為2.31±0.03，明顯高于正常組的（1.02±0.02）（t=101.196,P＜0.001）；第7 天高氧組AhR 的表達(dá)量為（4.21±0.03），明顯高于正常組的（1.86±0.02）（t=184.394,P＜0.001），見圖1B。

圖1 高氧條件下AhR在小鼠肺組織中的表達(dá)

2.2 肺組織中IL-33的含量

通過ELISA檢測肺組織勻漿上清液中IL-33的含量。結(jié)果顯示，第3 天高氧組IL-33 的表達(dá)量206.10±4.24，明顯高于正常組的（160.5±3.53）（t=23.378,P＜0.001）；第7 天高氧組IL-33 的表達(dá)量為439.35±5.65，明顯高于正常組的（297.98±5.57）（t=50.398,P＜0.001），見圖2。

圖2 高氧環(huán)境下IL-33在肺組織的表達(dá)

2.3 高氧條件下AhR在肺上皮細(xì)胞的表達(dá)

通過Western blotting 和qPCR 檢測AhR 在肺上皮細(xì)胞MLE-2的RNA和蛋白水平,高氧組AhR蛋白相對表達(dá)量為（0.59±0.12），明顯高于正常組的（0.34±0.09）（t=2.887,P=0.035),見圖3A；qPCR 結(jié)果顯示，AhR 在高氧組表達(dá)水平為（4.73±0.40），在正常組表達(dá)水平為1.03±0.12，高氧條件下AhR在肺上皮細(xì)胞MLE-2 中顯著上調(diào)（t=15.346,P＜0.001），見圖3B。

圖3 高氧條件下AhR在MLE-12細(xì)胞的表達(dá)

2.4 AhR轉(zhuǎn)染效率的測定

利用qPCR 技術(shù)檢測si-AhR 組和si-NC 組MLE-12 細(xì)胞中AhR 的表達(dá)，結(jié)果顯示，AhR 在si-NC 組表達(dá)為0.47±0.09，明顯低于在si-AhR 組中表達(dá)（1.04±0.08）（t=8.199,P＜0.001）,見圖4。

圖4 AhR 轉(zhuǎn)染效率的測定

2.5 AHR參與調(diào)控IL-33的表達(dá)

利用ELISA 檢測IL-33 在si-AhR 組和si-NC 組MLE-12 細(xì)胞上清液的含量，結(jié)果顯示，IL-33 在si-AhR組中表達(dá)為93.33±9.00，明顯低于在si-NC組中的表達(dá)（166.70±22.00）（t=5.346,P=0.003），見圖5A。通過qPCR 測定si-AhR 組和si-NC 組中IL-33的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，IL-33 在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)為（1.00±0.05），明顯低于在si-NC 中的表達(dá)（4.38±0.09），（t=56.862,P＜0.001），見圖5B。

圖5 A&B AhR轉(zhuǎn)染的MLE-12細(xì)胞中IL-33的表達(dá)

2.6 AhR激動實(shí)驗(yàn)的測定

通過Western blotting 檢測AhR 激動試驗(yàn)中的AhR 表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)組的AhR 相對表達(dá)量為0.68±0.14，明顯高于對照組的（0.32±0.10）（t=3.624,P=0.015)，見圖6。

圖6 AhR激動效率的測定

2.7 AhR調(diào)控IL-33的表達(dá)

通過ELISA 檢測AhR 激動試驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞上清液中IL-33 的表達(dá)。結(jié)果顯示，IL-33在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)為（167.00±19.00），明顯高于對照組的（265.70±12.00）（t=7.607,P=0.001），見圖7。

圖7 IL-33在AhR激動的MLE-12細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

BPD 作為一種臨床上多見于早產(chǎn)兒的慢性肺部疾病，組織學(xué)上表現(xiàn)為氧含量異常條件下肺上皮受損和肺上皮的局部炎癥[7]。有研究報(bào)道，BPD 患兒的血液和氣管抽吸物中促炎細(xì)胞因子（IL-1、IL-6和IL-8）顯著升高，提示炎癥是BPD 的關(guān)鍵病理過程[8]。有研究表明，IL-33 作為白介素家族的一員，主要由肺上皮細(xì)胞中表達(dá)，并在肺部固有免疫和特異性免疫中發(fā)揮重要功能，尤其是在急性氣道炎癥中發(fā)揮重要作用[9]。

有文獻(xiàn)表明，IL-33 參與炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而促進(jìn)高氧所致的新生兒肺損傷的發(fā)展[10]，且IL-33與支氣管肺發(fā)育不良的嚴(yán)重程度成正相關(guān)[11]。同時(shí)，在BPD中IL-33是參與調(diào)控肺泡細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子[12-13]。本研究利用新生鼠高氧肺損傷模型來模擬新生兒支氣管肺發(fā)育不良的病理過程，結(jié)果表明，IL-33 在新生鼠肺損傷過程中表達(dá)顯著上調(diào)，這與前人研究結(jié)果相符，說明IL-33在高氧致肺損傷過程中發(fā)揮重要的作用。但I(xiàn)L-33作為一種分泌性的蛋白因子，在高氧損傷的肺上皮中調(diào)控其表達(dá)的機(jī)制仍不清晰。

作為Per-ARNT-Sim-basic helix-loop-helix 蛋白家族中的一員,AhR是一類高度保守的核受體，通過調(diào)控靶基因的表達(dá)和改變免疫分化過程，在一系列由免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的疾病中均發(fā)揮重要的作用[14-15]。有研究表明[16]，激活A(yù)hR 可以顯著增加具有抗炎作用的Treg細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)降低有促炎功能的Th17細(xì)胞的數(shù)量。更有研究表明[17]，AhR的激活可以抑制Th17 細(xì)胞的分化，同時(shí)抑制NLRP3 炎癥小體的活性。芳香烴受體AhR 不僅參與調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的分化和募集，而且通過改變基因表達(dá)、細(xì)胞黏附、粘蛋白產(chǎn)生和細(xì)胞因子表達(dá)來影響肺的免疫應(yīng)答[18]。研究表明[19]，AhR 調(diào)控巨噬細(xì)胞分泌IL-10,從而抑制炎癥反應(yīng)的進(jìn)行，說明AhR 通過調(diào)控炎癥因子的表達(dá)介導(dǎo)炎癥發(fā)生發(fā)展過程。研究表明[20]，在巨噬細(xì)胞中，AhR 配體通過修飾IL-33啟動子，從而上調(diào)IL-33的表達(dá)，使氣道炎癥進(jìn)一步惡化。因此，推測在高氧損傷的肺上皮中，AhR可能參與調(diào)控IL-33的表達(dá)和分泌過程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高氧刺激下，新生鼠肺組織中的AhR 上調(diào)明顯。進(jìn)一步探究AhR與IL-33在肺損傷過程中的調(diào)節(jié)關(guān)系，利用siRNA和AhR激動劑來處理小鼠肺上皮細(xì)胞系MLE-12，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，肺上皮細(xì)胞中AhR 參與調(diào)節(jié)IL-33 的表達(dá)，進(jìn)一步說明在新生鼠肺損傷過程中，AhR通過調(diào)控炎癥因子IL-33，調(diào)控肺損傷過程的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，AhR在新生鼠高氧肺損傷的肺組織中特異性高表達(dá)并與損傷程度成正相關(guān)，并主要參與調(diào)控IL-33 的表達(dá)，從而發(fā)揮一系列的生理功能。AhR 可能可作為評估新生兒高氧肺損傷的損傷程度的關(guān)鍵分子，也可能是藥物治療的潛在靶點(diǎn)。