吳立晗，巫相宏，閉 奇，文偉明

（廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 530021）

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種慢性炎性疾病，而血管內(nèi)皮細(xì)胞是該病的驅(qū)動(dòng)場(chǎng)所[1]。AS 作為心血管疾病的常見致病原因，其病因?qū)W與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙有關(guān)[2]。炎癥反應(yīng)貫穿AS發(fā)病的各個(gè)階段，可能是多種致AS 因素致病機(jī)制的共同環(huán)節(jié)或通路。炎癥機(jī)制不僅與AS的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，且與AS多種并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)[3]。目前AS 的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未闡明。連接蛋白（Cx）構(gòu)成的縫隙連接間的小分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可介導(dǎo)AS 的發(fā)展，Cx43 作為成員之一，可在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等各種細(xì)胞中高表達(dá)，還可能與AS斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)[4]。既往研究表明，Cx43 在AS 的發(fā)生、發(fā)展中也具有關(guān)鍵作用，已被證實(shí)其低水平狀態(tài)可能導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)AS 進(jìn)展[5]。Toll 樣受體4（TLR4）參與了AS的致病機(jī)制，降低其表達(dá)有助于抑制AS病變以及相關(guān)炎癥反應(yīng)[6]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號(hào)通路在機(jī)體的炎性過程中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，抑制其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有利于抑制AS 的病理進(jìn)程[7]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）是主要負(fù)責(zé)脂肪酸和能量代謝的基因，其激動(dòng)劑對(duì)于抑制炎癥以及改善血管內(nèi)皮功能具有積極作用，目前已被證實(shí)可用于治療AS 等心血管疾病[8]。本研究旨在探討PPAR-γ 激動(dòng)劑羅格列酮干預(yù)TLR4/PI3K 信號(hào)通路對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的人冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HCAEC）炎癥損傷模型中Cx43表達(dá)的影響，為AS的治療和預(yù)防提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 HCAEC 細(xì)胞株、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青―鏈霉素及內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑（ECGS）均購于美國ScienCell 公司。PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮購自陶素生化科技公司；LPS 和TLR4 激動(dòng)劑KLA 購自美國Sigma 公司；PI3K 阻滯劑LY294002 及磷酸化（p-）PI3K p85 (Tyr458)/p55(Tyr199)抗體購自美國CST 公司；TLR4、Cx43 抗體購自英國Abcam 公司；RNA 提取試劑盒、引物購自日本TAKARA公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HCAEC培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素及100 U/mL ECGS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～3 d換液1次，待細(xì)胞密度至80%以上即可傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 用0.1 mg/L LPS刺激HCAEC 24 h建立體外細(xì)胞炎癥損傷模型，分為模型組、KLA組（0.01 mg/LKLA干預(yù)24 h）、LY294002組（20μmol/L LY294002 干預(yù)24 h）、羅格列酮組（50 μmol/L 羅格列酮干預(yù)24 h）、KLA+羅格列酮組（加入0.01 mg/L KLA干預(yù)24 h后加入50μmol/L羅格列酮繼續(xù)培養(yǎng)24 h）、LY294002+羅格列酮組（加入20 μmol/L LY294002干預(yù)24 h后加入50μmol/L羅格列酮繼續(xù)培養(yǎng)24 h）。另設(shè)空白組（不作任何處理）。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法檢測(cè)PI3K、TLR4及Cx43 mRNA 表達(dá) 使用TRIZOL 試劑提取各組細(xì)胞總RNA，微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的質(zhì)量和濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用ABI Prism 7500 型PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過2-△△Ct法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。以GAPDH作為內(nèi)參。引物序列如下：TLR4上游：5’-TGGCATCATCTTCATTGTC-3’，下游：5’-CAGAGCATTGTCCTCCCACT-3’；CX43 上游：5’-CCTCTCGCCTATGTCTCCTCCTG-3’，下游：5’-GACTGCTGGCTCTGCTTGAAGG-3’；PI3K 上游：5’-TGCCTGCTCTGTAGTGGTGGAC-3’，下游：5’-CGCTTCATCGCCTCTGCTGTG-3’。

1.5 Western blotting 法檢測(cè)p-PI3K、TLR4 及Cx43蛋白表達(dá) 將裂解液加入細(xì)胞中并在冰上作用10 min，離心，收集上清液；通過Bradford 法測(cè)定蛋白濃度，取30 μg 蛋白樣品在10% SDS-PAGE 分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜；10%山羊血清封閉1 h，加入一抗Cx43（1∶1 000）、TLR4（1∶500）、p-PI3K（1∶5 000）和GAPDH（1∶1 000）稀釋液于4 ℃冰箱孵育過夜；TBST緩沖液洗膜3次，加入HRP標(biāo)記山羊抗大鼠二抗（1∶4 000）（英國Abcam公司），室溫下孵育1 h，洗膜3 次。用ECL 化學(xué)發(fā)光液于Fluor Chem FC3 全能型成像系統(tǒng)中顯影，使用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS對(duì)Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 模型組Cx43 mRNA 和蛋白表達(dá)量明顯低于空白組（均P＜0.05），見圖1。

圖1 LPS對(duì)Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

2.2 羅格列酮對(duì)TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 KLA 組TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)量高于模型組（均P＜0.01），KLA+羅格列酮組的TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于KLA 組（均P＜0.05），見圖2。

圖2 4組細(xì)胞TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)量比較

2.3 羅格列酮對(duì)PI3K mRNA水平及蛋白表達(dá)水平的影響 LY294002組的PI3K mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組（均P＜0.05）；LY294002+羅格列酮組的PI3K mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯低于LY294002組（均P＜0.05），見圖3。

圖3 4組細(xì)胞PI3K的mRNA和蛋白表達(dá)量比較

2.4 羅格列酮介導(dǎo)TLR4/PI3K對(duì)Cx43 mRNA水平及蛋白表達(dá)水平的影響 KLA組Cx43 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組，LY294002 組Cx43 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于模型組（均P＜0.05），羅格列酮組Cx43 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于模型組（均P＜0.01）；KLA+羅格列酮組Cx43 mRNA 和蛋白表達(dá)水平高于KLA 組（均P＜0.05），LY294002+羅格列酮組Cx43 蛋白表達(dá)水平高于LY294002組（均P＜0.05），見圖4。

圖4 6組細(xì)胞Cx43 mRNA和蛋白表達(dá)量比較

3 討論

血管內(nèi)皮炎癥改變是AS 早期發(fā)病過程，Cx43已被證實(shí)有利于改善心臟的血管內(nèi)皮炎癥改變。既往研究中，在缺氧的條件下培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞建立心肌缺血模型，發(fā)現(xiàn)缺氧使Cx43蛋白水平降低約30%～50%，抑制MAPK信號(hào)通路后可以減輕Cx43的損失[9]。本研究對(duì)HCAEC 使用0.1 mg/L 的LPS建立炎癥模型，發(fā)現(xiàn)可顯著降低Cx43表達(dá)水平。有研究表明，TLR4 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，并且TLR4 激動(dòng)劑可以抑制Cx43 的表達(dá)，進(jìn)而影響敗血癥的預(yù)后，提示TLR4 與Cx43 存在某種調(diào)控機(jī)制[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，TLR4 激動(dòng)劑明顯下調(diào)HCAEC炎癥損傷模型中Cx43 mRNA 及蛋白表達(dá)（均P＜0.05），表明在LPS 刺激的HCAEC 中TLR4 對(duì)Cx43表達(dá)存在負(fù)調(diào)控作用。

Lu 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K 信號(hào)通路對(duì)于AS 病理過程具有一定推動(dòng)作用，其機(jī)制可能是通過激活Caspase-3 與NF-sB 進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及炎性反應(yīng)。Song等[12]研究表明，白藜蘆醇可通過介導(dǎo)PI3K信號(hào)通路調(diào)節(jié)心肌Cx43 蛋白水平進(jìn)而發(fā)揮抗心律失常的作用。本研究使用PI3K 通路抑制劑LY294002 進(jìn)行干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)HCAEC 炎癥損傷模型中Cx43 mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（均P＜0.01），提示阻斷PI3K 信號(hào)通路可減少炎癥對(duì)Cx43的破壞。

研究顯示，PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮能降低小鼠黑色素瘤中TLR4 蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤進(jìn)展[13]。本研究在HCAEC炎癥模型中加入PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮，發(fā)現(xiàn)可以降低TLR4 表達(dá)水平（P＜0.05）。既往研究發(fā)現(xiàn)，MiR-27a通過PPAR-γ介導(dǎo)的PI3K/AKT 信號(hào)，促進(jìn)胰島素抵抗并介導(dǎo)葡萄糖代謝，提示PPAR-γ與PI3K/AKT信號(hào)通路存在一定聯(lián)系[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮能顯著下調(diào)HCAEC 中p-PI3K 表達(dá)（P＜0.05）。此外，在Sun 等[15]研究中，色氨酸通過PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路調(diào)控TLR4 和PPAR-γ 發(fā)揮抗炎作用，保護(hù)HMEC-1 細(xì)胞免受LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，這表明PPAR-γ 與TLR4/PI3K 信號(hào)通路在內(nèi)皮損傷中存在一定作用。在本次實(shí)驗(yàn)中，KLA 或LY294002 干預(yù)后進(jìn)一步使用PPAR-γ 激動(dòng)劑羅格列酮，發(fā)現(xiàn)HCAEC 炎癥損傷模型中TLR4 和PI3K 的表達(dá)被抑制（均P＜0.05），同時(shí)，Cx43 的表達(dá)水平升高（P＜0.05）。表明PPAR-γ 激動(dòng)劑羅格列酮可通過抑制TLR4/PI3K 信號(hào)通路提高LPS 誘導(dǎo)的HCAEC 中Cx43的表達(dá)。

本研究證實(shí)了在HCAEC 中使用PPAR-γ 激動(dòng)劑羅格列酮可以抑制TLR4/PI3K信號(hào)通路，并上調(diào)Cx43 的表達(dá)水平。本研究仍可作進(jìn)一步的研究。首先，探討PPAR-γ 激活與TLR4/PI3K 之間的具體作用機(jī)制，通過補(bǔ)充基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，從動(dòng)物模型入手探究AS 中的Cx43 相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制以及PPAR-γ 激動(dòng)劑的治療效果；另外，也可以從miRNA角度出發(fā)，尋找對(duì)于PPAR-γ 介導(dǎo)TLR4/Cx43 軸存在的靶向調(diào)控作用的特異性miRNA，為AS中Cx43的調(diào)控機(jī)制探索潛在的上游靶點(diǎn)。