何江波 姚志芳 吳國(guó)芳 楊雨鑫* 王 磊*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌712100；2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧810016)

抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑曾被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖。但是，隨著抗生素濫用導(dǎo)致的食品安全問(wèn)題、生態(tài)環(huán)境問(wèn)題日益凸顯，其對(duì)人類健康存在潛在威脅?！吨腥A人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第194號(hào)》公告的發(fā)布，意味著抗生素類飼料添加劑在2020年7月1日后將成為歷史[1]。因此，在無(wú)抗養(yǎng)殖后時(shí)代探尋抗生素替代品意義重大[2]。有研究指出，益生菌制劑可以作為抗生素的有效替代物，發(fā)揮優(yōu)化動(dòng)物消化道菌群、改善飼料營(yíng)養(yǎng)代謝、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力的作用[3]。目前應(yīng)用較廣泛的益生菌主要包括乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等[4]。

目前，乳酸菌類微生態(tài)制劑應(yīng)用最為廣泛，它是指一類在厭氧或兼性厭氧條件下能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽(yáng)性、無(wú)芽孢細(xì)菌的總稱[5]。有報(bào)道稱乳酸菌在動(dòng)物消化道內(nèi)能夠抑制致病菌的生長(zhǎng)繁殖，阻止其代謝活動(dòng)，還能夠減少血清膽固醇和內(nèi)毒素含量，維持消化道內(nèi)微生態(tài)平衡，提高機(jī)體免疫功能[6]。而目前市場(chǎng)上乳酸菌制劑混亂，質(zhì)量參差不齊，通常由于活菌數(shù)不夠、活性弱、抗逆性不強(qiáng)、同源性差等原因，導(dǎo)致產(chǎn)品性能不穩(wěn)定、應(yīng)用效果不明顯等諸多問(wèn)題[7]。而且從菌制劑對(duì)宿主發(fā)揮作用的效果而言，同源性益生菌最佳[8]，但其相關(guān)機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。因此，根據(jù)實(shí)際動(dòng)物生產(chǎn)需要，篩選同源性并在益生功能及抗逆性方面表現(xiàn)良好的菌株是益生菌研究的關(guān)鍵問(wèn)題，決定了乳酸菌制劑的使用效果[9]。

鑒于此，本研究擬從健康羊瘤胃內(nèi)容物中分離篩選出生長(zhǎng)速率、產(chǎn)酸能力、耐酸和耐膽鹽性能、抑菌能力及自凝集率等方面表現(xiàn)良好的菌株，同時(shí)還應(yīng)考慮菌株安全特性，通過(guò)對(duì)菌株的抗生素敏感性檢測(cè)，避免抗性基因傳播，為開發(fā)適應(yīng)養(yǎng)羊生產(chǎn)的乳酸菌制劑提供理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

分別從青海省貴南縣以及西藏拉薩地區(qū)自然放牧羊群中各隨機(jī)挑選3只1歲、體重在30～35 kg、健康的黑藏羊和白絨山羊，放血致死后取出瘤胃，快速無(wú)菌采集新鮮瘤胃內(nèi)容物于50 mL滅菌離心管中，冷藏并迅速送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

本試驗(yàn)涉及的培養(yǎng)基配制主要參照凌代文[10]試驗(yàn)方法。MRS肉湯培養(yǎng)基：乙酸鈉5 g、檸檬酸三胺2 g、磷酸氫二鉀2 g、四水合硫酸錳0.25 g、硫酸鎂0.58 g、吐溫-80 1 mL、蛋白胨10 g、酵母抽提物5 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g，加蒸餾水至1 L；含有碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基：在MRS肉湯中加入瓊脂20 g、碳酸鈣10 g，加蒸餾水至1 L；PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g、酵母提取物1.0 g、胰酶解酪胨0.5 g、鹽溶液4.0 mL、蒸餾水1 L。

1.1.3 試劑盒

細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

參照王利紅[11]試驗(yàn)方法，將瘤胃內(nèi)容物用生理鹽水按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀釋，取各梯度稀釋液均勻涂布MRS-CaCO3瓊脂培養(yǎng)基平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，待平板上出現(xiàn)單菌落，挑取具有明顯溶鈣圈且形狀、大小、顏色各異的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，純化3～4次，編號(hào)標(biāo)記，并于30%甘油中-80 ℃保存，作為初步篩選試驗(yàn)的菌株。

1.2.2 菌株初篩

參照王利紅[11]試驗(yàn)方法，取干凈玻片，用接種環(huán)取1環(huán)菌液于玻片上，涂勻，待干燥后，固定，進(jìn)行革蘭氏染色。油鏡(10×100)鏡檢，觀察記錄菌株形態(tài)，經(jīng)革蘭氏染色后呈紫色，為陽(yáng)性菌，呈紅色為革蘭氏陰性菌。同時(shí)菌株進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，觀察是否有氣泡產(chǎn)生，如有氣泡，則為過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性菌，沒有氣泡，則為過(guò)氧化氫酶陰性菌，若革蘭氏染色陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶接觸陰性則可初步確定為乳酸菌。

1.2.3 菌株種屬鑒定

將初篩純化的菌種保存液充分活化后，離心收集菌體，根據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒方法提取菌體DNA，以提取DNA為模板，PCR擴(kuò)增16S rRNA基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增子送往生物公司進(jìn)行測(cè)序，以鑒定乳酸菌的種屬。PCR引物采用16S通用引物序列[12]：16S-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGC-3′，16S-R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 S；55 ℃退火1 min；72 ℃延伸1.5 min；30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

1.3 優(yōu)良乳酸菌的篩選

1.3.1 乳酸菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)

參照程麗娟等[13]試驗(yàn)方法，PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)加入30 g/L葡萄糖和0.5 mL/L吐溫-80，以16 g/L的溴甲酚紫作指示劑，分裝至試管，在試管內(nèi)倒置杜氏試管，121 ℃滅菌20～30 min，接種乳酸菌后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)基的顏色由紫色變?yōu)辄S色表示產(chǎn)酸，培養(yǎng)基中杜氏試管頂端出現(xiàn)氣泡，表明其產(chǎn)氣，為異型發(fā)酵乳酸菌，未出現(xiàn)氣泡，為同型發(fā)酵乳酸菌。

1.3.2 乳酸菌生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酸能力測(cè)定

參照崔棹茗等[14]試驗(yàn)方法進(jìn)行乳酸菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酸能力測(cè)定，對(duì)篩選出的同型發(fā)酵乳酸菌，經(jīng)活化后按照1%接種量接種于5 mL MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8、12、16、24、36、48 h，隨機(jī)抽取3管，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下的吸光度(OD)，同時(shí)測(cè)定菌液的pH，以菌液培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD和pH為縱坐標(biāo)分別繪制生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線。

1.3.3 耐酸和耐膽鹽性能測(cè)定

參照李利等[15]試驗(yàn)方法進(jìn)行耐酸和耐膽鹽性能測(cè)定。

耐酸性能：將供試菌株接種于MRS培養(yǎng)基中，厭氧條件下37 ℃培養(yǎng)24 h。用6 mol/L的鹽酸分別調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基pH至4.0、3.0、2.5。將活化的乳酸菌分別接種未調(diào)pH培養(yǎng)基及調(diào)pH至4.0、3.0、2.5的MRS培養(yǎng)基中，并調(diào)整其初始OD在0.025±0.005，37 ℃培養(yǎng)24 h，以相應(yīng)pH未接種的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各組菌液的OD。

耐膽鹽性能：與耐酸性能測(cè)定相似，將活化的乳酸菌分別轉(zhuǎn)接至含0、1、2和3 g/L的牛膽鹽MRS培養(yǎng)基，并調(diào)整其初始OD在0.025±0.005，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)24 h，以未接種的相應(yīng)膽鹽濃度培養(yǎng)基為空白對(duì)照，于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各組菌液的OD。

1.3.4 菌株上清液抑菌性能測(cè)定

參照崔素素[12]抑菌性試驗(yàn)方法，以沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。將候選菌株于MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)活化2代，將活化好的菌液離心(8 000×g)2 min，上清液經(jīng)濾膜過(guò)濾，收集后分為等量的2份，1份不調(diào)pH，1份將pH調(diào)至6.8，吸取150 μL加入牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)24 h后檢測(cè)有機(jī)酸是否對(duì)指示菌產(chǎn)生抑制作用，抑菌能力根據(jù)抑菌圈大小判定，判定方法參考高擎燏[16]的試驗(yàn)研究。

1.3.5 自凝集試驗(yàn)

參照李龍等[17]試驗(yàn)方法，將候選菌株活化24 h后離心(8 000×g)5 min，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，PBS重懸，調(diào)整菌懸液的OD為0.25±0.05，記錄起始OD(A0)，吸取4 mL已調(diào)整OD的菌懸液加入試管中，靜置于室溫下20 h后測(cè)定該菌懸液上清在600 nm波長(zhǎng)下的OD(At)，計(jì)算自凝集率(A，%)=[(A0-At)/A0]×100。

1.3.6 藥敏性試驗(yàn)

參照封曄等[18]的藥敏性試驗(yàn)方法，將候選菌株制成菌懸液，均勻涂布于MRS平板培養(yǎng)基上，將青霉素、四環(huán)素、鏈霉素、氧氟沙星、多黏菌素B、紅霉素、環(huán)丙沙星、妥布霉素8類抗菌藥物藥敏片均勻置于平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄抑菌圈大小，根據(jù)抑菌圈大小判定藥敏性，判定標(biāo)準(zhǔn)參考美國(guó)NCCLS文件及文獻(xiàn)[19]進(jìn)行制定(表1)。

表1 不同抗生素藥敏性判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，采用SPSS 20和GraphPad Prism 8軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化

共分離純化得到疑似乳酸菌101株，所有菌株革蘭氏染色均呈陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶觸反應(yīng)均呈陰性，部分菌株在MRS平板培養(yǎng)的菌落特征和革蘭氏染色見圖1所示。

A1、A2、A3分別為不同菌株菌落形態(tài)；B1、B2、B3分別為對(duì)應(yīng)菌株革蘭氏染色。

2.2 16S rRNA測(cè)序鑒定

分別提取101株經(jīng)革蘭氏染色呈陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶觸反應(yīng)呈陰性菌株的DNA，經(jīng)16S rRNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的片段大小均在1 500 bp處出現(xiàn)單一熒光條帶，沒有明顯拖尾現(xiàn)象，符合測(cè)序要求，部分菌株的PCR擴(kuò)增電泳圖如圖2所示。隨后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后，測(cè)序結(jié)果登陸NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，根據(jù)其相似度確定得到25株乳酸菌，如表2所示，分離得到的25株乳酸菌中8株戊糖片球菌和2株短乳桿菌均分離自黑藏羊瘤胃內(nèi)容物，明串株菌分離自白絨山羊瘤胃內(nèi)容物，在黑藏羊和白絨山羊瘤胃內(nèi)容物中均分離出了戊糖乳桿菌、糞腸球菌、海氏腸球菌、蒙氏腸球菌。

表2 25株乳酸菌16S rRNA序列相似性比對(duì)

M：DL2000 DNA標(biāo)記物；1～12號(hào)依次是菌株H1、H2、H7、H9、H12、H15、H17、H18、H20、H23、H24、H25的基因組DNA。

2.3 優(yōu)良乳酸菌篩選

2.3.1 發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣

圖3 部分菌株產(chǎn)酸產(chǎn)氣結(jié)果

2.3.2 生長(zhǎng)曲線

如圖4-A所示，8株戊糖片球菌中菌株H1、H2、H3、H5、H6、H7、H8均在接種4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌株H4在接種6 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，均在16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，48 h時(shí)的OD600在2.2～2.3；由圖4-B可知，8株腸球菌均在接種2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期所有菌株均在接種12 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，8株腸球菌在48 h時(shí)OD600均在1.5左右，其中菌株H12、H13最高，菌株H9、H10、H11最低；由圖4-C可知，6株戊糖乳桿菌均在接種2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，48 h時(shí)的OD600均接近2.5，其中菌株H22在4和48 h時(shí)的OD600均低于其余5株菌。

圖A、B、C分別代表8株戊糖片球菌、8株腸球菌、6株戊糖乳桿菌生長(zhǎng)曲線。圖5同。

2.3.3 產(chǎn)酸曲線

由圖5可知，所有菌株在培養(yǎng)過(guò)程中pH的變化規(guī)律基本一致，都呈現(xiàn)先穩(wěn)定后下降再穩(wěn)定的階段，綜合圖3生長(zhǎng)曲線的結(jié)果，乳酸菌處于適應(yīng)期時(shí)，培養(yǎng)基pH變化基本保持穩(wěn)定，當(dāng)菌株生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)基pH開始下降，菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，pH又開始趨于穩(wěn)定。由圖5-A可知，8株戊糖片球菌在48 h時(shí)的pH均能達(dá)到4.0以下，菌株H2、H3、H5、H6、H7、H8在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后pH快速下降，其中菌株H7的pH下降最快，菌株H8的pH下降最慢，菌株H1、H4進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，菌株H1的pH迅速下降，但菌株H4的pH在8 h后開始快速下降；由圖5-B可知，8株腸球菌在48 h時(shí)的pH接近，均在4.2～4.5，其中菌株H12、H13的pH下降最快，且48 h時(shí)的pH也最低，菌株H9、H10、H11的pH下降最慢，在48 h時(shí)的pH高于其余5株菌；由圖5-C可知，6株戊糖乳桿菌均在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后pH快速下降，其中菌株H22的pH下降速率低于其他菌株，但在48 h時(shí)的pH接近且均低于4.0。

圖5 22株乳酸菌產(chǎn)酸曲線

綜合22株同型發(fā)酵乳酸菌的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸速率的結(jié)果得出：戊糖片球菌中菌株H2、H3、H5、H6、H7生長(zhǎng)性能和產(chǎn)酸性能較好；腸球菌中菌株H12、H13生長(zhǎng)性能和產(chǎn)酸性能最好，H14、H15、H16次之，H9、H10、H11最差，戊糖乳桿菌中菌株H22較差。

2.3.4 耐酸和耐膽鹽性能

由表3可知，所有菌株均能在培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，整體生長(zhǎng)速度戊糖乳桿菌優(yōu)于戊糖片球菌，腸球菌的生長(zhǎng)速度較慢。所有菌株在pH 4.0的條件下均能生長(zhǎng)，其中戊糖片球菌的生長(zhǎng)幾乎不受影響，說(shuō)明此8株戊糖片球菌均能完全耐受pH 4.0條件；8株腸球菌生長(zhǎng)受到抑制作用，其中菌株H9、H10、H11生長(zhǎng)微弱，基本不耐受此酸度環(huán)境，菌株H12、H13、H14、H15、H16生長(zhǎng)較好，說(shuō)明能耐受此環(huán)境條件，其中菌株H13耐受性最好；6株戊糖乳桿菌能完全耐受pH 4.0的環(huán)境，生長(zhǎng)良好。在pH 3.0條件下，8株戊糖片球菌長(zhǎng)勢(shì)較好，但也受到一定程度的抑制，其中菌株H6耐受性最差；8株腸球菌的生長(zhǎng)被完全抑制不能生長(zhǎng)；6株戊糖乳桿菌耐酸性強(qiáng)，長(zhǎng)勢(shì)較好。pH 2.5條件下，8株戊糖片球菌和6株戊糖乳桿菌生長(zhǎng)微弱，基本不能耐受此酸性環(huán)境，但戊糖乳桿菌整體耐受能力優(yōu)于戊糖片球菌。

由表3可知，所有菌株均能很好地耐受0.1%的膽鹽環(huán)境。在0.2%的膽鹽條件下，8株戊糖片球菌長(zhǎng)勢(shì)良好，說(shuō)明能耐受此膽鹽環(huán)境，其中菌株H7的耐受性能最好；8株腸球菌長(zhǎng)勢(shì)較好，但均受到一定抑制作用；6株戊糖乳桿菌長(zhǎng)勢(shì)較好，說(shuō)明其能耐受此膽鹽環(huán)境，其中菌株H20最好，H22最差。在0.3%的膽鹽條件下，8株戊糖片球菌能在一定程度上耐受此膽鹽環(huán)境，其中菌株H1、H4耐受性能最差；8株腸球菌長(zhǎng)勢(shì)微弱，其中菌株H12耐受能力最強(qiáng)，H14、H15、H16次之，其余最差；6株戊糖乳桿菌，菌株H17、H18、H19、H20長(zhǎng)勢(shì)較好，說(shuō)明這4株菌能耐受此膽鹽環(huán)境，菌株H21、H22長(zhǎng)勢(shì)微弱，說(shuō)明不能耐受此環(huán)境。

表3 22株乳酸菌在不同pH及膽鹽條件下24 h時(shí)OD600的變化

綜合這22株菌對(duì)酸和膽鹽的耐受性能結(jié)果得出：8株戊糖片球菌中菌株H2、H3、H5、H7、H8對(duì)酸和膽鹽耐受性較好；8株腸球菌中菌株中H12、H14、H15、H16對(duì)酸和膽鹽耐受性較好；6株戊糖乳桿菌中H17、H18、H19、H20對(duì)酸和膽鹽耐受性較好。

?Leana，C．，Appelbaum，E．＆ Shevchuk，I．，“Work process and quality of care in early childhood education:the role of job crafting”，Academy of Management Journal，2009，52(6)，pp．1169～1192．

2.3.5 候選菌株抑菌能力

由表4可知，22株乳酸菌上清原液對(duì)指示菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均產(chǎn)生了抑制作用，除了菌株H5、H6、H11，其余菌株上清液對(duì)指示菌沙門氏菌也均產(chǎn)生了抑制作用，但是存在菌株特異性。8株戊糖片球菌中，菌株H2、H3、H7、H8對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)；8株腸球菌中H10、H15沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)；6株戊糖乳桿菌中H17、H18、H20對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)。而pH調(diào)至6.8的乳酸菌上清液及MRS培養(yǎng)基，均未檢測(cè)出對(duì)指示菌的抑制作用。部分菌株抑菌效果如圖6所示。

表4 22株乳酸菌對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌能力

2.3.6 自凝集率

22株乳酸菌在靜置20 h后凝集率如圖7所示，菌株特異性明顯，其中菌株H1自凝集率最高，菌株H12自凝集率最低。

圖A的指示菌為沙門氏菌，菌株分別為H17、H2、H4、H5；圖B的指示菌為金黃色葡萄球菌，菌株分別為H18、H17、H7、H15；圖C的指示菌為大腸桿菌，菌株分別為H2、H15、H17、H18；a、b、c分別為MRS培養(yǎng)基，上清液調(diào)pH至6.8，上清液原液。

圖7 22株乳酸菌自凝集率

2.3.7 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果(表5)發(fā)現(xiàn)，所有菌株對(duì)鏈霉素都具有耐藥性。8株戊糖片球菌對(duì)青霉素、四環(huán)素、紅霉素3種藥物敏感，除了菌株H4對(duì)多黏菌素B敏感，8株菌對(duì)其余5種藥物均具有耐藥性；8株腸球菌對(duì)鏈霉素、多黏菌素B、妥布霉素3種藥物均具有耐藥性，其中菌株H9、H11、H15、H16對(duì)4～5種藥物敏感，H12、H13只對(duì)四環(huán)素敏感；6株戊糖乳桿菌均對(duì)鏈霉素、多黏菌素B、環(huán)丙沙星具有耐藥性，菌株H18對(duì)4種藥物敏感，H20對(duì)2種藥物敏感，其余菌株均對(duì)3種藥物敏感，部分菌株的抗生素敏感性效果如圖8所示。

表5 22株乳酸菌對(duì)不同抗生素的敏感性判定

續(xù)表5菌株編號(hào)Strain number青霉素Penicillin四環(huán)素Tetracycline鏈霉素Streptomycin氧氟沙星Ofloxacin多黏菌素BPolymyxin B紅霉素Erythromycin環(huán)丙沙星Ciprofloxacin妥布霉素TobramycinH4ISRRSSRRH5SSRRRSRRH6SSRRRSRRH7SSRRRSRRH8SSRRRSRRH9ISRSRSRRH10IIRRRSRRH11SSRIRSSRH12RSRRRRRRH13RSRRRRRRH14ISRRRSRRH15ISRIRIIRH16ISRSRSRRH17ISRRRSRRH18SIRRRSRIH19SSRRRSRRH20SRRRRIRRH21SIRRRSRRH22SSRRRSRR

藥敏紙片a、b、c、d、e、f、g、h分別代表抗生素青霉素、四環(huán)素、鏈霉素、氧氟沙星、多黏菌素B、紅霉素、環(huán)丙沙星、妥布霉素。

3 討 論

乳酸菌是近年來(lái)應(yīng)用最廣泛的一種安全性較高的新型綠色功能性飼料添加劑，具有提高飼料利用率、改善動(dòng)物消化道功能、提高免疫力等益生功能[20-21]。針對(duì)不同動(dòng)物而言，其消化道環(huán)境以及微生物組成均有所不同[22]。因此，篩選具有高效、穩(wěn)定等益生特點(diǎn)的同源性益生菌的研究就顯得尤為重要。菌株是否能作為益生菌，需要根據(jù)現(xiàn)有益生菌選擇標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)價(jià)規(guī)程對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)估[23]。而作為直接投喂的菌制劑，首要問(wèn)題是要考慮其進(jìn)入動(dòng)物胃腸道后的存活和定植，所以篩選菌株時(shí)應(yīng)選擇來(lái)自同種動(dòng)物宿主分離的益生菌，使其具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力[24]。在本試驗(yàn)中對(duì)分離自不同品種羊瘤胃中的菌株先通過(guò)形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性進(jìn)行初步鑒定，然后進(jìn)行了16S rRNA分子生物學(xué)鑒定，提高了鑒定的準(zhǔn)確率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)篩選獲得的25株乳酸菌，包括4個(gè)不同的屬，7個(gè)不同的種，其中同型發(fā)酵乳酸菌22株，異型發(fā)酵乳酸菌3株。戊糖片球菌和短乳桿菌均來(lái)自黑藏羊，而明串株菌來(lái)自白絨山羊，戊糖乳桿菌、糞腸球菌、蒙氏腸球菌、海氏腸球菌則存在于2種羊瘤胃中，說(shuō)明不同品種、不同來(lái)源的羊瘤胃中乳酸菌分布不同、多樣性也存在差異，分析原因可能是動(dòng)物胃腸道乳酸菌群的形成主要來(lái)源于自然環(huán)境中乳酸菌的定植，而不同地域環(huán)境、不同氣候條件又孕育了不同乳酸菌資源，同時(shí)不同品種的羊消化道環(huán)境也可能適應(yīng)不同乳酸菌的生長(zhǎng)，不同乳酸菌之間存在的協(xié)同或拮抗作用可能影響乳酸菌的分布，因此導(dǎo)致不同品種、不同來(lái)源的羊瘤胃中分離得到的乳酸菌種類不同，宿利亞[25]的研究也說(shuō)明了不同地域、不同動(dòng)物腸道或畜產(chǎn)品能分離出一些地域特色的益生菌。隨后對(duì)22株同型發(fā)酵乳酸菌進(jìn)行了體外生物學(xué)特性評(píng)價(jià)。乳酸菌的生長(zhǎng)速度及產(chǎn)酸能力是篩選益生菌的重要指標(biāo)，無(wú)論是直接投喂還是應(yīng)用于發(fā)酵飼料，生長(zhǎng)速度快，能迅速繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌群，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制其他病原微生物的生長(zhǎng)；產(chǎn)酸能力強(qiáng)，能快速產(chǎn)生大量乳酸等有機(jī)酸，形成低pH環(huán)境，抑制有害菌的生長(zhǎng)[26-27]。鑒于此，本研究根據(jù)養(yǎng)羊生產(chǎn)需要，對(duì)分離得到的22株同型發(fā)酵乳酸菌進(jìn)行生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酸能力研究，結(jié)果表明，8株戊糖片球菌中菌株H2、H3、H5、H6、H7生長(zhǎng)性能和產(chǎn)酸性能較好；8株腸球菌中菌株H12、H13生長(zhǎng)性能和產(chǎn)酸性能最好，H14、H15、H16次之，H9、H10、H11較差，戊糖乳桿菌中菌株H22較差；另外生長(zhǎng)速度及產(chǎn)酸能力存在菌株特異性，本試驗(yàn)中戊糖片球菌和戊糖乳桿菌整體優(yōu)于腸球菌，所有菌株均在接種2～6 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。王蔚淼等[28]研究結(jié)果顯示，乳酸菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期一般在接種后12～24 h，這與本研究結(jié)果不一致可能原因是菌株不同所致。靳勝男等[29]的研究顯示，乳酸菌在接種4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，與本研究結(jié)果基本一致。在本研究中分離到的乳酸菌其生長(zhǎng)速度不同，部分菌株生長(zhǎng)較快，具有作為優(yōu)良發(fā)酵接種菌的潛力。此外在產(chǎn)酸速度方面，不同種屬乳酸菌產(chǎn)酸能力不同，但基本都在發(fā)酵4 h后產(chǎn)生大量有機(jī)酸，pH快速下降，發(fā)酵24 h后pH趨于穩(wěn)定，戊糖片球菌和戊糖乳桿菌終末pH能達(dá)到3.8左右，而腸球菌均在4.0以上。

作為優(yōu)良益生菌制劑，除了應(yīng)具有較好的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸性能外，也應(yīng)當(dāng)能適應(yīng)胃腸道中的苛刻環(huán)境。因此對(duì)22株乳酸菌進(jìn)行了耐酸、耐膽鹽試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明8株戊糖片球菌在pH 2.5條件下微弱生長(zhǎng)，對(duì)pH 3.0及膽鹽濃度0.3%的環(huán)境均具有較好的耐受性，其中菌株H2、H3、H5、H7、H8表現(xiàn)較好；8株腸球菌均完全不能耐受pH 3.0以下環(huán)境，其中菌株H12、H13、H14、H15、H16對(duì)pH 4.0耐受性能較好，所有菌株均能在一定程度上耐受0.3%的膽鹽濃度；6株戊糖乳桿菌在pH 2.5條件下微弱生長(zhǎng)，均能耐受pH 3.0的酸性條件及0.3%的膽鹽濃度其中H17、H18、H19、H20對(duì)酸和膽鹽耐受性較好，結(jié)果表明乳酸菌不同種屬及同一種屬不同菌株耐酸和耐膽鹽性能可能不同。Missotten等[30]對(duì)10株乳酸菌耐酸性能研究也顯示不同菌株耐酸性能存在差異，這和本研究結(jié)果基本一致。在沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌能力方面，所有菌株上清液對(duì)指示菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有不同程度的抑制作用，其中菌株H1、H2、H18抑制作用最強(qiáng)，除了菌株H5、H6、H11其余菌株上清液對(duì)沙門氏菌也均有不同程度抑制作用，其中菌株H17、H20抑菌作用最強(qiáng)。在排除酸效應(yīng)后，所有菌株上清液均未檢測(cè)到抑制作用，李雪莉等[31]研究也表明乳酸菌主要通過(guò)有機(jī)酸來(lái)發(fā)揮抑制作用，這與本研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明乳酸菌主要通過(guò)代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸來(lái)發(fā)揮抑菌作用的，但也有研究表明乳酸菌可通過(guò)細(xì)菌素、過(guò)氧化氫等發(fā)揮抑菌效果[32]，在本研究中可能原因是除有機(jī)酸外沒有其他抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生或者產(chǎn)生的濃度過(guò)低所致。

菌株的自凝集是指相同菌株間相互凝集形成多細(xì)胞簇的過(guò)程，乳酸菌可通過(guò)自凝集形成阻礙致病菌在腸道定植和感染的屏障[33]。菌株自凝集應(yīng)該作為篩選菌株的重要指標(biāo)，能間接反應(yīng)菌株的黏附特性，自凝集率高的菌株有高的疏水性和黏附率[34]。在本試驗(yàn)中大多數(shù)菌株的自凝集率都在40%～50%，但是存在菌株特異性，最高可達(dá)63.2%，最低為36.7%，本試驗(yàn)結(jié)果表明，大多數(shù)菌株具有較強(qiáng)的自凝集能力，這與前人試驗(yàn)研究結(jié)果[17,35]一致。

乳酸菌的使用歷史悠久，通常被認(rèn)為是一種安全的菌種，但是不合理菌株的使用可能對(duì)宿主健康產(chǎn)生危害。而作為益生菌的一個(gè)重要安全要求就是不可攜帶可轉(zhuǎn)移抗性基因[36]。抗性基因可通過(guò)橫向轉(zhuǎn)移，從而使菌株對(duì)使用的抗生素產(chǎn)生耐藥性。因此益生菌的候選菌株必須鑒定其抗生素敏感性。本試驗(yàn)評(píng)價(jià)了22株乳酸菌對(duì)8種常用抗生素的耐藥性。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，戊糖片球菌和戊糖乳桿菌中除了菌株H4對(duì)多黏菌素B敏感，菌株H18對(duì)妥布霉素中度敏感，都表現(xiàn)出對(duì)鏈霉素、氧氟沙星、多黏菌素B、環(huán)丙沙星、妥布霉素的耐藥性，腸球菌中菌株H11、H15對(duì)鏈霉素、多黏菌素B、妥布霉素出現(xiàn)耐藥性，對(duì)其余抗生素敏感，本試驗(yàn)結(jié)果與前人的試驗(yàn)結(jié)果[19,37]基本一致，但因菌株來(lái)源及抗生素不同也存在不同之處。分析產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是不同菌株攜帶的天然耐藥基因不同，也可能是由于在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中長(zhǎng)期低水平抗生素使用刺激相關(guān)抗性基因轉(zhuǎn)移，形成獲得性耐藥，更有可能與菌株來(lái)源密切相關(guān)。由于目前對(duì)于益生菌藥敏性評(píng)價(jià)還缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，后期也需要更多的深入研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)研究成功篩選出H2、H7、H15、H17、H18 5株優(yōu)良同型發(fā)酵乳酸菌，其中戊糖片球菌2株、海氏腸球菌1株、戊糖乳桿菌2株，均具有良好的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸能力和抗逆性，后期將對(duì)其安全性進(jìn)行進(jìn)一步研究，為其作為抗生素替代品在畜禽養(yǎng)殖中應(yīng)用提供理論依據(jù)。